Asepsiksen saavuttaminen – Sterilointimenetelmän valinta.

Mikro-organismien ja biologisen materiaalin sterilointi on edellytys sekä kokeelliselle että ympäristön hallinnalle lukuisilla eri tieteenaloilla toimivissa laboratorioissa. 

Olipa kyseessä sitten aseptisten olosuhteiden varmistaminen viljelylevyllä tai bioturvallisuusalueen ylläpito, sterilointin tavoitteena on aina ei-toivottujen biologisten tekijöiden hävittäminen. Tämä tavoite voidaan saavuttaa useilla eri menetelmillä, joista jokaisella on omat etunsa ja haittansa.

Ihanteellisen sterilointiprosessin on toimittava nopeasti ja tehokkaasti; sen on inaktivoitava mikro-organismit ja ei-toivotut biologiset aineet, kuten prionit. Sen tulisi myös varmistaa mahdollisimman vähäinen myrkyllisyys, käyttäjille aiheutuvat terveysriskit ja steriloitaviin esineisiin kohdistuvat muutokset, samalla kun se tarjoaa maksimaalisen mukautuvuuden – soveltuen erilaisille materiaaleille. Menettelyn tulisi myös pystyä voittamaan steriloitavien materiaalien osoittama fyysinen vastustuskyky sterilointia vastaan. Kaikki tämä tulisi ihannetapauksessa saavuttaa kustannustehokkaasti, mikä mahdollistaa myös johdonmukaisen seurannan [1] [2]. 

Kaikkien näiden ehtojen täyttäminen on kuitenkin usein epäkäytännöllistä. Näin ollen monien näiden tekijöiden huomioon ottaminen jää usein toissijaiseksi huolenaiheeksi tilanteen ja tarpeen mukaan, ja ensisijaisena tavoitteena on saavuttaa aseptisuus toimivassa lopputuotteessa. Seuraavassa arvioidaan yleisesti käytettävissä olevia sterilointimenetelmiä sekä niiden etuja ja haittoja.

Steriili suodatus

Jos nestemäinen aine on tarkoitus steriloida, suodatus on yksi harkittava vaihtoehto. Neste tai kaasu voidaan johtaa sterilointisuodattimen kalvon läpi, joka muodostaa mekaanisen esteen kaikille hiukkasille, joiden halkaisija on suurempi kuin kalvon huokosten halkaisija. Huokosia suuremmat mikro-organismit jäävät suodattimen taakse, mikä varmistaa, etteivät ne pääse suodokseen. 

Lämpö, säteily ja kemialliset sterilointiaineet vaikuttavat muuttamalla mikro-organismien molekyylien ja organellien fysikaalisia rakenteita – prosessi, joka voi muuttaa myös herkempien aineiden rakenteellisia komponentteja. Suodatuksella ei ole tällaisia vaikutuksia, vaan se poistaa vain tietyn koon ylittävät hiukkaset. Siten suodatus on järkevä valinta epävakaammille ja reaktiivisemmille nesteille.

Toisin kuin muut sterilointimenetelmät, suodatus ei inaktivoi mikrobiologisia organismeja. Siksi suodattimen ja käsittelyn jälkeisten jäännösten sterilointiin tarvitaan muita sterilointimenetelmiä – usein lämpöä tai säteilyä.

Erityistä huomiota on kiinnitettävä myös suodattimen huokoskokoon. Usein käytetään 0,2 μm:n huokoskokoa – ja koska pienin mykoplasma on kooltaan noin 0,3 μm – tämä riittää useimpien bakteerien suodattamiseen pois. Ultramikrobien koko voi kuitenkin olla alle 0,1 μm [3] [4] [5], kun taas virukset ja prionit ovat usein vieläkin pienempiä. Huokoskoon pienentäminen 0,001 μm:iin varmistaa, että suodokseen pääsee vähemmän mikrobiologisia organismeja, vaikka tämä rajoittaa yhä enemmän suodatettavien nesteiden määrää. Huokoskoon pienentäminen pidentää myös käsittelyaikaa – 0,1 μm:n huokoskoon omaavan suodattimen virtausnopeus on noin 40 % 0,2 μm:n huokoskoon omaavan suodattimen virtausnopeudesta.

Säteily

Säteily on monimuotoinen sterilointimenetelmä. Ionisoiva säteily kattaa röntgen-, gamma- ja elektronisäteet. Nämä tekniikat herättävät sähkömagneettisesti hiukkasia steriloitavalla alueella, jolloin vapautuu vapaita radikaaleja. Nämä radikaalit sitoutuvat biomolekyylien (kuten DNA:n, RNA:n ja entsyymien) kaksoissidoksiin, muuttavat niiden rakennetta, estävät niiden toiminnan ja johtavat niitä sisältävien mikro-organismien toimintakyvyttömyyteen. Ei-ionisoiva säteily toimii aiheuttamalla uusien sidosten – pyrimidiinidimeerien – muodostumisen DNA:n nukleotidisidosten välille, mikä – kuten ionisoivan säteilyn tapauksessa – muuttaa makromolekyylin rakennetta ja estää sen toiminnan. 

Toimintaperiaatteensa vuoksi säteilysterilointiaineet voivat hajottaa orgaanisia kemikaaleja, kuten muoveja [6] [7], ja biologista materiaalia. Valitettavasti niiden hajottavat vaikutukset eivät ulotu prioneihin, jotka ovat pääosin liian stabiileja säteilysterilointiaineiden vaikutuksille. [8] On kuitenkin syytä huomata, että joissakin tutkimuksissa on osoitettu prionien denaturoitumisen mahdollisuus gammasäteilyn avulla [9]. 

Toinen tärkeä huomioitava seikka on, että säteilysterilointiaineiden läpäisykyky ja käsittelyajat vaihtelevat merkittävästi.  Ultraviolettivalo (UV) pystyy läpäisemään vain läpinäkyviä materiaaleja, minkä vuoksi se soveltuu ilman ja puhdistetun käänteisosmoosiveden sterilointiin, mutta läpinäkymättömien aineiden osalta se rajoittuu pintasterilointiin. UV-valon käsittelyaika voi myös kestää tunteja, kuten röntgensäteiden ja gammasäteilyn tapauksessa. Näillä kahdella jälkimmäisellä menetelmällä on kuitenkin omat etunsa. 

Gammak- ja röntgensäteet tunkeutuvat erittäin syvälle, mikä mahdollistaa niiden käytön esineiden sterilointiin, jotka sijaitsevat läpäisemättömissä säiliöissä. Elektronisäde-sterilointi toteutuu lähes välittömästi. Usein sitä käytetään pintasterilointimenetelmänä elektronihiukkasten heikon tunkeutumiskyvyn vuoksi – riittävällä energialla sekin voi kuitenkin tunkeutua syvälle aineeseen.

Röntgen-, elektronisäde- ja UV-sterilointimenetelmien käyttökustannukset voivat olla suhteellisen alhaiset, ja niille kaikille on ominaista tehokas sähkönkäyttö. Röntgen-, elektronisäde- ja gammasäteilylaitteiden alkuinvestointikustannukset ovat korkeat [10]. Gammasterilointiin liittyy jatkuvia kustannuksia, jotka johtuvat säteilylähteen, yleensä koboltti-60-isotoopin, vaihtamisesta. On kuitenkin syytä huomioida, että vaikka käyttäjät tulisi aina suojata kaikkien säteilysterilointimenetelmien haitallisilta vaikutuksilta, radioaktiivisen materiaalin fyysinen läsnäolo gammasterilointilaitteissa edellyttää ylimääräisiä varotoimia laitteen huollon aikana.    

Kemialliset

Kemialliset sterilointiaineet käsittävät laajan valikoiman nesteitä ja kaasuja, joilla on yksi yhteinen piirre – kyky tuhota mikrobeja. Näiden ominaisuuksien vuoksi ne ovat usein haitallisia ihmisille, elleivät jopa tappavia. Yleisimmin käytetty kemiallinen sterilointiaine – etyleenioksidi – voi aiheuttaa lyhyellä aikavälillä päänsärkyä, pahoinvointia, oksentelua, ripulia, hengenahdistusta, hengitysteiden ärsytystä, keuhkovaurioita ja syanoosia, kun taas pitkäaikainen altistuminen liittyy syövän esiintymiseen, mutageenisiin muutoksiin, neurotoksisuuteen ja herkistymiseen [11]. 

Etyleenioksidikaasu steriloi proteiinien, DNA:n ja RNA:n alkyloinnin kautta, mikä tekee mikro-organismeista elinkelvottomia [7]. Tämä prosessi johtuu yhdisteen suuresta reaktiivisuudesta; tämä ominaisuus aiheuttaa logistisia ongelmia. Myrkyllisyyden ja syttyvyyden yhdistelmän vuoksi etyleenioksidia suositellaan säilytettäväksi erillisessä varastotilassa – ja vuototilanteen varalta on määritettävä 100 metrin säteellä oleva eristysvyöhyke [12]. 

Kuten useimpien kemiallisten sterilointiaineiden kohdalla, etyleenioksidi on tehoton prionien suhteen ja voi jättää jäämiä steriloituihin pintoihin. Sen sterilointiaika on myös pitkä – 2–5 tuntia – ja käsittelyaika vielä pidempi; usein yli 14 tuntia sterilointia seuraavan höyrynpoiston vuoksi. Se tunkeutuu kuitenkin erittäin hyvin, toimii alhaisissa lämpötiloissa (29–65 °C) eikä reagoi useimpien muovien kanssa.  

Yksi mielenkiintoinen edistysaskel tällä alalla on kaasuplasmasterilointi. Vetyperoksidikaasuplasma syntyy, kun vetyperoksidihöyryä viritetään sähkökentän avulla, jolloin siitä vapautuu vapaita radikaaleja, jotka denaturoivat biologisia materiaaleja, kuten ionisoivassa säteilymenetelmässä. Vetyperoksidikaasuplasman on osoitettu olevan tehokas prioneja vastaan, se toimii alhaisissa lämpötiloissa (37–44 °C) ja sen käsittelyaika on alle 75 minuuttia [13]. Menetelmän tunkeutumiskyky on kuitenkin heikko, ja sen perustana oleva vetyperoksidi on myrkyllinen ja räjähtävä aine.

Lämpö

Lämpösterilointi on vanhin ja yksinkertaisin menetelmä, ja sitä on kahta tyyppiä – kuivasterilointi ja höyrysterilointi. Lämpösteriloinnin keskeisiä etuja ovat sen kyky tuhota kaikki biologinen materiaali (mukaan lukien prionit) jättämättä jälkeensä epäpuhtauksia tai jäämiä [14]. Toinen etu on alhaiset kustannukset, erityisesti kulutustarvikkeiden osalta: tarvitaan korkeintaan vain sähköä ja vettä. Lämpösterilointiin liittyvät vaarat ovat myös vähäisiä, vaikka kuumien steriloitujen esineiden koskettamisesta voi aiheutua palovammoja. 

Lämpösterilointi vaikuttaa ensin steriloitavan esineen ulkopintoihin ja leviää sitten sisäänpäin, kunnes koko materiaali on steriloitu. Lämpö denaturoi mikro-organismeissa ja biologisessa materiaalissa esiintyvät proteiinit, ja koska prionit ovat proteiineja, myös ne altistuvat lämpösteriloinnin vaikutuksille. Denaturointiprosessi muuttaa vety- ja disulfidisidoksia sekä suolasiltoja ja muuttaa proteiinien sekundaarista, tertiääristä ja kvaternaarista rakennetta, jolloin ne menettävät toimintakykynsä biologisissa prosesseissa [15].

Kuivakuumasterilointi edellyttää 160–170 °C:n lämpötilan luomista ja sen ylläpitämistä kahden–neljän tunnin ajan. Tämän ajan ja lämpötilan yhdistelmän vuoksi lämpöherkkien materiaalien, kuten muovien, sterilointi tällä menetelmällä ei ole mahdollista ilman materiaalin hajoamista [16]. Terät on perinteisesti steriloitu kuivakuumalla, koska höyryn pelätään tylsyttävän niitä. Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että höyryllä steriloitujen ruostumattomasta teräksestä valmistettujen terien terävyyden heikkeneminen on merkityksetöntä [17].

Höyrysterilointi on nopeampi ja vähemmän lämpöä vaativa prosessi kuin kuivakuumasterilointi. Höyry siirtää lämpöenergiaa tehokkaammin kuin kuuma ilma, minkä ansiosta sterilointiin riittää matalampi lämpötila (121–134 °C) ja lyhyempi aika (3–15 minuuttia). Veden kiehumispiste ilmakehän paineessa on 100 °C, mikä on liian alhainen sterilointiprosessia varten. Siksi höyryä on tuotettava paineistetussa ympäristössä, mikä nostaa veden kiehumispisteen vaadittuun lämpötilaan. 

Esineet, jotka kestävät enintään 134 °C:n lämpötilaa, voidaan steriloida höyryllä, mutta niiden on kestettävä lämpötilan, kosteuden ja paineen yhdistelmää. Niille, jotka kestävät tämän, höyrysterilointi on erittäin tehokas ja syvälle tunkeutuva sterilointimenetelmä.

Yhteenveto

Lopullista johtopäätöstä sterilointimenetelmästä ei ole helppo tehdä. On kuitenkin mahdollista selviytyä monimutkaisuudesta ja löytää oikea vaihtoehto keskittymällä ensisijaisesti kyseessä oleviin esineisiin ja niiden vaadittavaan kuntoon sterilointin jälkeen.

Suodatus on erinomainen vaihtoehto niille, jotka sterilisoivat rajoitetun määrän nesteitä – etenkin sellaisia, jotka ovat herkkiä lämmölle, säteilylle ja kemialliselle sterilointille. Päätöksiä on kuitenkin tehtävä tietoisena siitä, että menetelmä on riippuvainen muista sterilointimuodoista mikro-organismien inaktivoimiseksi.

Säteily kattaa useita eri läpäisykykyisiä muunnelmia ja on hyvä vaihtoehto, jos materiaalit ovat lämpöherkkiä ja kestävät säteilyn vahingollisia vaikutuksia. Sen käyttöönotto on kuitenkin kallista, ja sen kustannustehokkuus riippuu käyttölaajuudesta.

Kemiallinen sterilointi aiheuttaa myrkyllisyys-, jäämä- ja logistiikkavaatimuksia sekä jatkuvia kulutustarvikekustannuksia, mutta sillä on oma roolinsa, kun steriloitava kohde ei sovellu muihin sterilointitekniikoihin – esimerkiksi lämpö- ja säteilyherkkä kiinteä materiaali.

Esineille, jotka eivät ole herkkiä lämmölle, kosteudelle ja – jossain määrin – paineelle, höyrysterilointi nousee usein parhaaksi vaihtoehdoksi, sillä se tarjoaa kustannustehokkuutta, tehokkuutta ja nopeutta. Tämä pätee myös jätteisiin, joiden kunto sterilisoinnin jälkeen ei ole merkityksellinen. Siksi autoklaavi on edelleen välttämätön laite lähes kaikissa laboratorioissa, kun taas höyryllä lämmitettävät jäteveden puhdistusjärjestelmät (EDS) tarjoavat erinomaisen vaihtoehdon niille, joilla on hävitettävänä biologisesti aktiivista nestemäistä jätettä. Ota yhteyttä Astell Scientificiin osoitteessa Info@Astell.com, jos tarvitset lisätietoja höyrypohjaisesta lämpösteriloinnista.  

Steriloitavan materiaalin analysoinnin avulla on mahdollista löytää sterilointitekniikka, joka sopii parhaiten ihanteelliseen malliin. Nopeuden, tehokkuuden, materiaalin yhteensopivuuden, myrkyttömyyden, mukautettavuuden ja seurattavuuden yhdistelmää voidaan arvioida kunkin tilanteen tarpeiden mukaan, samoin kuin kykyä ylittää kohdemateriaalissa mahdollisesti esiintyvä materiaalin vastustuskyky. Tietenkin kustannustehokkuus on avaintekijä useimmissa organisaatioissa.

Lähteet

1. Schneider, P. (1994). Matalalämpötilaiset sterilointivaihtoehdot 1990-luvulla. Tappi Journal; (Yhdysvallat), 77(1).

2. Rutala, William A. ja David J. Weber. ”Matalan lämpötilan sterilointiteknologioiden kliininen tehokkuus.” Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (kesäkuu 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Haettu 26. syyskuuta 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). ”Ultramikrobit: käsitteen muodostuminen ja ultramikrobien merkitys biologiassa”. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (huhtikuu 1997). ”Uudet anaerobiset ultramikrobit, jotka kuuluvat Verrucomicrobiales-sukuun ja jotka on eristetty laimennusviljelyllä hapettomasta riisipellon maaperästä”. Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Gamma-säteilyllä tapahtuvan sterilisoinnin riskit: kolikon kääntöpuoli. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Julkaistu 18.1.2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell & Connor, J. (2011). Synteettisten ja biologisten biomateriaalien sterilointi. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Ohjeet prionien saastuttamien lääketieteellisten instrumenttien desinfioinnista ja sterilisoinnista. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Prionien tarttuvuuden inaktivointi ionisoivilla säteillä. Radiation Physics and Chemistry, 76(11–12), 1760–1762.

10. Simmons, A. (2012). Biomateriaalien ja lääkinnällisten laitteiden sterilointiin liittyvät tulevaisuuden suuntaukset. Teoksessa Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Yhdysvaltain työministeriö, 2020. Etyleenioksidi. [verkossa] Työturvallisuus- ja työterveysvirasto (Occupational Safety and Health Administration). Saatavilla osoitteessa: [Viitattu 25. syyskuuta 2020].

12. National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem-yhdisteen yhteenveto CID 6354, etyleenioksidi. Haettu 23. syyskuuta 2020 osoitteesta https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Vetyperoksidikaasuplasma | Desinfiointi- ja sterilointiohjeet | Ohjekirjasto | Tartuntojen torjunta. Haettu 27. syyskuuta 2020 osoitteesta https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Biomateriaalien ja lääkinnällisten laitteiden höyry- ja kuivakuumasterilointi. Teoksessa Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Elintarvikeproteiinien lämpökäsittely.

16. Vinny R. Sastri (2014). Lääkinnällisissä laitteissa käytettävien muovien materiaalivaatimukset, teoksessa Plastics in Medical Devices (toinen painos).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Höyry- ja kuivakuumasteriloinnin vaikutus ortodontisten ligatuurileikkauspihdien kulumiseen. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467–471.

Julkaistu alun perin Labmate UK & Ireland -lehdessä, volyymi 45, numero 7.