Dosiahnutie asepsy – výber sterilizačného postupu.

Sterilizácia mikrobiálneho života a biologického materiálu je nevyhnutnou podmienkou experimentálnej aj environmentálnej kontroly v laboratóriách naprieč nespočetnými disciplínami. 

Či už ide o zabezpečenie aseptických podmienok v kultivačnej miske alebo o udržanie priestoru s biologickou izoláciou, cieľom sterilizácie je vždy odstránenie nežiaducich biologických činiteľov. Tento cieľ je možné dosiahnuť prostredníctvom rôznych postupov, z ktorých každý má svoje vlastné výhody a nevýhody.

Ideálny sterilizačný proces musí fungovať rýchlo a efektívne; musí deaktivovať mikroorganizmy a nežiaduce biologické materiály, ako sú priony. Mal by tiež zabezpečiť minimálnu toxicitu, minimálne zdravotné riziká pre obsluhu a minimálne zmeny na sterilizovaných objektoch, pričom by mal poskytovať maximálnu prispôsobivosť – zohľadňovať rôzne materiály. Postup by mal byť tiež schopný prekonať akýkoľvek fyzikálny odpor voči sterilizácii, ktorý vykazujú sterilizované materiály. Všetko toto by sa malo dosiahnuť nákladovo efektívnym spôsobom, ktorý zároveň umožňuje dôsledné monitorovanie [1] [2]. 

Splnenie všetkých týchto kritérií je však často nepraktické. Z tohto dôvodu sa mnohé z týchto faktorov často považujú za druhoradé v závislosti od situácie a potreby, pričom primárnym cieľom je dosiahnutie asepse vo funkčnom konečnom produkte. Nasleduje posúdenie bežne dostupných metód sterilizácie, ich kladov a záporných stránok.

Sterilná filtrácia

Ak sa má sterilizovať tekutá látka, je možné zvážiť filtráciu. Kvapalinu alebo plyn je možné prehnúť cez sterilizačnú filtračnú membránu, ktorá tvorí mechanickú bariéru pre všetky častice s priemerom väčším ako póry v membráne. Mikroorganizmy väčšie ako póry zostávajú zachytené za filtrom, čím sa zabezpečí, že sa nemôžu dostať do filtrátu. 

Teplo, žiarenie a chemické sterilizátory pôsobia tak, že menia fyzikálne štruktúry molekúl a organel v mikroorganizmoch – tento proces môže zmeniť aj štrukturálne zložky citlivejších látok. Filtrácia nemá takéto účinky, odstraňuje iba častice nad určitú veľkosť. Ako taká predstavuje filtrácia vhodnú voľbu pre nestálejšie a reaktívnejšie kvapaliny.

Na rozdiel od iných metód sterilizácie filtrácia nedeaktivuje mikrobiologické entity. Preto sú na sterilizáciu filtra a zvyškov po spracovaní potrebné ďalšie sterilizačné postupy – často teplo alebo žiarenie.

Veľkú pozornosť treba venovať aj veľkosti pórov vo filtri. Často sa používa veľkosť pórov 0,2 μm – a keďže najmenšia mykoplazma meria približne 0,3 μm – to stačí na odfiltrovanie väčšiny baktérií. Ultramikrobaktérie však môžu mať veľkosť menšiu ako 0,1 μm [3] [4] [5], zatiaľ čo vírusy a priony sú často ešte menšie. Zmenšenie veľkosti pórov na 0,001 μm zaručuje, že do filtrátu sa dostane menej mikrobiologických častíc, hoci to čoraz viac obmedzuje množstvo tekutín, ktoré je možné filtrovať. Zmenšenie veľkosti pórov tiež predlžuje dobu spracovania – filter s veľkosťou pórov 0,1 μm bude mať prietok približne 40 % v porovnaní s filtrom s veľkosťou pórov 0,2 μm.

Žiarenie

Ako sterilizant má žiarenie viacero foriem. Uveďme napríklad sterilizanty využívajúce ionizujúce žiarenie, medzi ktoré patria röntgenové lúče, gama lúče a elektrónové lúče. Tieto technológie sterilizujú elektromagnetickým vzbudením častíc v sterilizovanej oblasti, čím spôsobujú uvoľňovanie voľných radikálov. Tieto radikály sa spájajú s dvojitými väzbami v biomolekulách (ako sú DNA, RNA a enzýmy), čím menia ich štruktúru, zastavujú ich funkciu a vedú k znefunkčneniu mikroorganizmov, ktoré ich obsahujú. Sterilizačné prostriedky využívajúce neionizujúce žiarenie pôsobia tak, že spôsobujú tvorbu nových väzieb – pyrimidínových dimérov – medzi nukleobázami v DNA, čo – podobne ako pri ionizujúcom žiarení – mení štruktúru makromolekuly a zastavuje jej fungovanie. 

Vďaka svojej funkčnosti môžu sterilizačné prostriedky využívajúce žiarenie rozkladať organické chemikálie, ako sú plasty [6] [7], a biologický materiál. Bohužiaľ, ich degradačné účinky sa nevzťahujú na priony, ktoré zostávajú vo veľkej miere príliš stabilné na to, aby na ne pôsobili sterilizačné prostriedky využívajúce žiarenie. [8] Stojí však za zmienku, že niektoré štúdie poukazujú na možnosť denaturácie prionov prostredníctvom gama žiarenia [9]. 

Ďalším dôležitým hľadiskom je, že penetračná schopnosť a doby pôsobenia sterilizačných prostriedkov založených na žiarení sa výrazne líšia.  Ultrafialové žiarenie (UV) preniká len priehľadnými materiálmi, čo z neho robí vhodný prostriedok na sterilizáciu vzduchu a čistej vody z reverznej osmózy, avšak pri nepriehľadných látkach je obmedzený na povrchovú sterilizáciu. Doba pôsobenia UV žiarenia sa môže pohybovať v hodinách, rovnako ako v prípade röntgenového a gama žiarenia. Tieto dve posledné metódy však prinášajú svoje vlastné výhody. 

Gama a röntgenové žiarenie majú vysokú priepustnosť, čo znamená, že sa dajú použiť na sterilizáciu predmetov umiestnených v inak nepropustných nádobách. Hlavnou prednosťou sterilizácie elektrónovým lúčom je takmer okamžitá sterilizácia. Často sa používa ako povrchový sterilizant kvôli nízkej priepustnosti elektrónových častíc – avšak pri dostatočnej energii môže aj tento lúč hlboko preniknúť do hmoty.

Prevádzkové náklady na röntgenové žiarenie, elektrónový lúč a UV žiarenie môžu byť relatívne nízke, pričom efektívne využívanie elektrickej energie je charakteristickou vlastnosťou všetkých týchto metód. Zariadenia na röntgenové žiarenie, elektrónový lúč a gama žiarenie majú vysoké počiatočné investičné náklady [10]. Gama sterilizácia má priebežné náklady spojené s výmenou zdroja žiarenia, ktorým je zvyčajne izotop kobaltu-60. Treba však uznať, že hoci by prevádzkovatelia mali byť vždy chránení pred škodlivými účinkami všetkých sterilizačných prostriedkov využívajúcich žiarenie, fyzická prítomnosť rádioaktívneho materiálu v gama sterilizátoroch znamená, že počas údržby zariadenia je potrebné prijať dodatočné bezpečnostné opatrenia.    

Chemické

Chemické sterilizanty zahŕňajú širokú škálu kvapalín a plynov, ktoré spája jedna spoločná vlastnosť – schopnosť ničiť mikrobiálny život. Vzhľadom na tieto vlastnosti sú pre ľudí často škodlivé, ak nie smrteľné. Najčastejšie používaný chemický sterilizant – etylénoxid – môže v krátkodobom horizonte spôsobiť bolesti hlavy, nevoľnosť, zvracanie, hnačku, dýchavičnosť, podráždenie dýchacích ciest, poškodenie pľúc a cyanózu, zatiaľ čo dlhodobá expozícia je spojená s výskytom rakoviny, mutagénnymi zmenami, neurotoxicitou a senzibilizáciou [11]. 

Plynný etylénoxid sterilizuje prostredníctvom alkylácie bielkovín, DNA a RNA, čo vedie k životaschopnosti mikroorganizmov [7]. Tento proces prebieha v dôsledku vysokej reaktivity tejto zlúčeniny; táto vlastnosť vedie k logistickým komplikáciám. Vzhľadom na kombináciu jeho toxicity a horľavosti sa odporúča skladovať etylénoxid v samostatnej skladovacej jednotke — s izolačnou zónou o polomere 100 m vytvorenou pre prípad úniku [12]. 

Podobne ako väčšina chemických sterilizantov, etylénoxid je neúčinný voči prionom a môže zanechávať zvyšky na sterilizovaných povrchoch. Doba sterilizácie je tiež dlhá – medzi 2 a 5 hodinami – a doba spracovania ešte dlhšia; často presahuje 14 hodín kvôli odstraňovaniu par po sterilizácii. Napriek tomu má vysokú penetračnú schopnosť, pôsobí pri nízkych teplotách (v rozmedzí 29–65 °C) a nereaguje s väčšinou plastov.  

Ďalším zaujímavým pokrokom v tejto oblasti je sterilizácia plynovou plazmou. Plazma z plynného peroxidu vodíka vzniká excitáciou pary peroxidu vodíka pomocou elektrického poľa, čo spôsobuje uvoľňovanie voľných radikálov, ktoré denaturujú biologické materiály, podobne ako pri postupe s ionizujúcim žiarením. Ukázalo sa, že plynná plazma z peroxidu vodíka je účinná proti prionom, funguje pri nízkych teplotách (37–44 °C) a má dĺžku cyklu menej ako 75 minút [13]. Tento proces má však slabú penetračnú schopnosť a peroxid vodíka, na ktorom je založený, je toxická a výbušná látka.

Teplo

Tepelná sterilizácia je najstarším a najjednoduchším spôsobom sterilizácie a má dve formy – suchú a parnú. K hlavným výhodám tepelnej sterilizácie patrí jej schopnosť zničiť všetky biologické materiály (vrátane prionov) bez zanechania kontaminantov alebo zvyškov [14]. Ďalšou výhodou sú nízke prevádzkové náklady, najmä na spotrebný materiál: potrebná je len elektrina a voda. Riziká spojené s tepelnou sterilizáciou sú tiež nízke, hoci existuje riziko popálenia pri dotyku s horúcimi sterilizovanými predmetmi. 

Tepelná sterilizácia pôsobí najskôr na vonkajšie povrchy sterilizovaného predmetu a potom sa šíri dovnútra, až kým nie je sterilizovaný celý materiál. Teplo denaturuje bielkoviny nachádzajúce sa v mikroorganizmoch a biologickom materiáli, a keďže priony sú bielkoviny, pôsobí na ne tiež tepelná sterilizácia. Denaturačný proces mení vodíkové a disulfidové väzby, ako aj soľné mostíky, a mení sekundárnu, terciárnu a kvartérnu štruktúru bielkovín, čím ich znefunkčňuje pre biologické procesy [15].

Sterilizácia suchým teplom spočíva vo vytvorení prostredia s teplotou 160 °C až 170 °C a v jej udržiavaní po dobu dvoch až štyroch hodín. Táto kombinácia času a teploty znamená, že sterilizácia materiálov citlivých na teplo, ako sú plasty, pomocou tejto metódy nie je realizovateľná bez poškodenia materiálu [16]. Čepele sa tradične sterilizujú suchým teplom, keďže existujú obavy, že para by ich mohla otupiť. Štúdie však preukázali, že čepele z nehrdzavejúcej ocele sterilizované parou vykazujú zanedbateľné otupenie [17].

Sterilizácia parou je rýchlejší a menej teplotne náročný proces ako sterilizácia suchým teplom. Para prenáša tepelnú energiu účinnejšie ako horúci vzduch, čo umožňuje dosiahnuť sterilizáciu pri nižšej teplote (121 °C – 134 °C) a v kratšom čase (3 až 15 minút). Bod varu vody pri atmosférickom tlaku je 100 °C, čo je pre sterilizačný proces príliš nízka teplota. Preto je potrebné paru vytvárať v tlakovom prostredí, čím sa bod varu vody zvýši na požadovanú teplotu. 

Predmety, ktoré znesú teplotu 134 °C alebo nižšiu, možno sterilizovať parou, musia však byť schopné odolať kombinácii teploty, vlhkosti a tlaku. Pre tie, ktoré to zvládnu, predstavuje parná sterilizácia vysoko účinnú a dôkladnú formu sterilizácie.

Zhrnutie

Konečný záver týkajúci sa sterilizácie nie je jednoznačný. Je však možné zorientovať sa v tejto zložitej problematike a nájsť správnu voľbu, ak sa budeme sústrediť predovšetkým na dané predmety a ich požadovaný stav po sterilizácii.

Filtrácia predstavuje vhodnú voľbu pre sterilizáciu obmedzeného množstva tekutín – najmä tých, ktoré sú citlivé na teplo, žiarenie a chemickú sterilizáciu. Rozhodnutia sa však musia prijímať s vedomím, že tento mechanizmus je závislý od iných foriem sterilizácie na deaktiváciu mikroorganizmov.

Žiarenie, ktoré zahŕňa viacero variantov s rôznou penetračnou schopnosťou, je vhodnou voľbou pre materiály citlivé na teplo, ktoré dokážu odolať jeho škodlivým účinkom. Jeho zavedenie je však nákladné a jeho nákladová efektívnosť závisí od rozsahu použitia.

Chemická sterilizácia, hoci je spojená s toxicitou, zvyškami a logistickými obavami, ako aj s priebežnými nákladmi na spotrebný materiál, má svoje opodstatnenie v prípadoch, keď je sterilizovaný predmet nekompatibilný s inými sterilizačnými technikami – napríklad pevný materiál citlivý na teplo a žiarenie.

Pre predmety, ktoré nie sú citlivé na teplo, vlhkosť a – do určitej miery – tlak, sa ako vynikajúca voľba často javí parná sterilizácia, ktorá ponúka nákladovú efektívnosť, účinnosť a rýchlosť. To platí aj pre odpadové materiály, pri ktorých nie je dôležitý ich stav po sterilizácii. Autokláv preto zostáva nevyhnutným zariadením pre takmer všetky laboratóriá, zatiaľ čo systémy dekontaminácie odpadových vôd (EDS) využívajúce parný ohrev poskytujú vynikajúcu alternatívu pre tých, ktorí potrebujú likvidovať biologicky aktívny kvapalný odpad. Ak potrebujete viac informácií o parnej tepelnej sterilizácii, kontaktujte spoločnosť Astell Scientific na adrese Info@Astell.com.  

Analýzou sterilizovaného materiálu je možné nájsť sterilizačnú techniku, ktorá najlepšie zodpovedá ideálnemu modelu. Pre danú situáciu je možné posúdiť kombináciu rýchlosti, účinnosti, kompatibility s materiálom, netoxickosti, prispôsobivosti a možnosti monitorovania, ako aj schopnosť prekonať akúkoľvek odolnosť, ktorá sa môže vyskytovať v cieľovom materiáli. Samozrejme, nákladová efektívnosť bude kľúčovým faktorom vo väčšine organizácií.

Referencie

1. Schneider, P. (1994). Alternatívy nízkoteplotnej sterilizácie v 90. rokoch. Tappi Journal; (Spojené štáty), 77(1).

2. Rutala, William A. a David J. Weber. „Klinická účinnosť technológií nízkoteplotnej sterilizácie.“ Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (jún 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Citované 26. septembra 2017.

4. Duda, V.; Suzina, N.; Polivtseva, V.; Boronin, A. (2012). „Ultramikrobaktérie: Vznik pojmu a prínos ultramikrobaktérií pre biológiu“. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (apríl 1997). „Nové anaeróbne ultramikrobaktérie patriace do línie Verrucomicrobiales, izolované z anoxickej pôdy ryžových polí pomocou riediacej kultúry“. Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Riziká používania sterilizácie gama žiarením: Druhá strana mince. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Uverejnené 18. januára 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell a Connor, J. (2011). Sterilizácia biomateriálov syntetického a biologického pôvodu. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Usmernenie pre dezinfekciu a sterilizáciu zdravotníckych nástrojov kontaminovaných prionmi. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inaktivácia infekčnosti prionov ionizujúcim žiarením. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760–1762.

10. Simmons, A. (2012). Budúce trendy v sterilizácii biomateriálov a zdravotníckych pomôcok. V publikácii Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Ministerstvo práce Spojených štátov amerických, 2020. Etylénoxid. [online] Správa bezpečnosti a ochrany zdravia pri práci. Dostupné na: [Prístup 25. septembra 2020].

12. Národné centrum pre biotechnologické informácie (2020). Súhrn informácií o zlúčenine PubChem pre CID 6354, etylénoxid. Načítané 23. septembra 2020 z https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Plazma z plynného peroxidu vodíka | Usmernenia pre dezinfekciu a sterilizáciu | Knižnica usmernení | Kontrola infekcií. Citované 27. septembra 2020 z https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilizácia biomateriálov a zdravotníckych pomôcok parou a suchým teplom. V publikácii Sterilizácia biomateriálov a zdravotníckych pomôcok (s. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Tepelné spracovanie potravinových bielkovín.

16. Vinny R. Sastri (2014). Požiadavky na materiály pre plasty používané v zdravotníckych pomôckach, v publikácii Plastics in Medical Devices (druhé vydanie).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Vplyv sterilizácie parou v porovnaní so sterilizáciou suchým teplom na opotrebenie ortodontických klieští na strihanie ligatúr. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467–471.

Po prvýkrát uverejnené v časopise Labmate UK & Ireland, ročník 45, číslo 7.