Assurer l'asepsie - Choisir une méthode de stérilisation.

La stérilisation des micro-organismes et du matériel biologique est une condition préalable indispensable au contrôle tant expérimental qu'environnemental dans les laboratoires de nombreuses disciplines. 

Qu'il s'agisse de garantir des conditions aseptiques dans une boîte de culture ou de maintenir une zone de confinement biologique, l'objectif de la stérilisation est toujours l'éradication des agents biologiques indésirables. Cet objectif peut être atteint par divers procédés, chacun présentant ses propres avantages et inconvénients.

Le processus de stérilisation idéal doit être rapide et efficace, en désactivant les micro-organismes et les matières biologiques indésirables telles que les prions. Il doit également garantir une toxicité minimale, des risques sanitaires réduits pour les opérateurs et une altération minimale des objets stérilisés, tout en offrant une adaptabilité maximale — s'adaptant à différents matériaux. La procédure doit également être capable de surmonter toute résistance physique à la stérilisation présentée par les matériaux à stériliser. Idéalement, tout cela devrait être réalisé de manière rentable, ce qui permet également un suivi constant [1] [2]. 

Cependant, il est souvent difficile de remplir toutes ces conditions. Par conséquent, la prise en compte de bon nombre de ces facteurs est souvent secondaire, en fonction de la situation et des besoins, l'objectif principal étant d'obtenir un produit final fonctionnel et aseptisé. Ce qui suit est une évaluation des méthodes de stérilisation couramment disponibles, ainsi que de leurs avantages et inconvénients.

Filtration stérile

Si un produit fluide doit être stérilisé, la filtration constitue une option à envisager. Un liquide ou un gaz peut être fait passer à travers une membrane filtrante stérilisante, qui forme une barrière mécanique contre toutes les particules dont le diamètre est supérieur à celui des pores de la membrane. Les micro-organismes plus gros que les pores sont piégés derrière le filtre, ce qui garantit qu’ils ne peuvent pas pénétrer dans le filtrat. 

La chaleur, les rayonnements et les agents stérilisants chimiques agissent en modifiant les structures physiques des molécules et des organites au sein des micro-organismes – un processus qui peut également altérer les composants structurels de substances plus sensibles. La filtration n'a pas de tels effets, elle se contente d'éliminer les particules dépassant une certaine taille. À ce titre, la filtration constitue un choix plausible pour les fluides plus instables et réactifs.

Contrairement à d'autres méthodes de stérilisation, la filtration n'inactive pas les entités microbiologiques. Par conséquent, d'autres procédures de stérilisation – souvent la chaleur ou les rayonnements – sont nécessaires pour stériliser le filtre et les résidus après le traitement.

Une attention particulière doit également être portée à la taille des pores du filtre. On utilise fréquemment une taille de pores de 0,2 μm — et le plus petit mycoplasme mesurant environ 0,3 μm — ce qui est suffisant pour filtrer la plupart des bactéries. Cependant, les ultramicrobactéries peuvent mesurer moins de 0,1 μm [3] [4] [5], tandis que les virus et les prions sont souvent encore plus petits. Réduire la taille des pores à 0,001 μm garantit qu'un nombre moindre d'entités microbiologiques puisse pénétrer dans le filtrat, bien que cela devienne de plus en plus contraignant pour les fluides pouvant être filtrés. Une diminution de la taille des pores augmente également le temps de traitement : un filtre à pores de 0,1 μm aura un débit d'environ 40 % de celui d'un filtre à pores de 0,2 μm.

Rayonnement

En tant qu'agent stérilisant, le rayonnement prend plusieurs formes. Prenons, par exemple, les agents stérilisants par rayonnement ionisant, notamment les rayons X, les rayons gamma et les faisceaux d'électrons. Ces technologies stérilisent en excitant électromagnétiquement les particules dans la zone à stériliser, ce qui les amène à libérer des radicaux libres. Ces radicaux se combinent avec les doubles liaisons des biomolécules (telles que l'ADN, l'ARN et les enzymes), modifiant leur forme, interrompant leur fonction et rendant inactifs les micro-organismes qui les contiennent. Les agents stérilisants à rayonnement non ionisant agissent en provoquant la formation de nouvelles liaisons – des dimères de pyrimidine – entre les bases nucléiques de l'ADN, ce qui, comme avec le rayonnement ionisant, modifie la structure de la macromolécule et interrompt son fonctionnement. 

En raison de leur mode d'action, les agents stérilisants par rayonnement peuvent dégrader des composés organiques tels que les plastiques [6] [7] et les matières biologiques. Malheureusement, leurs effets dégradants ne s'étendent pas aux prions, qui restent largement trop stables pour être affectés par les agents stérilisants par rayonnement. [8] Il convient toutefois de noter que certaines études montrent une possibilité de dénaturation des prions par rayonnement gamma [9]. 

Il convient également de noter que la capacité de pénétration et les temps de traitement des agents stérilisants par rayonnement varient considérablement.  La lumière ultraviolette (UV) ne peut pénétrer que les matériaux transparents, ce qui en fait un agent stérilisant viable pour l'air et l'eau purifiée par osmose inverse, mais elle se limite à une stérilisation de surface pour les substances opaques. Le temps de traitement des UV peut également s'étendre sur plusieurs heures, comme c'est le cas pour les rayons X et les rayons gamma. Cependant, ces deux dernières méthodes présentent leurs propres avantages. 

Les rayons gamma et les rayons X sont hautement pénétrants, ce qui signifie qu'ils peuvent être utilisés pour stériliser des objets contenus dans des récipients autrement imperméables. Le principal atout de la stérilisation par faisceau d'électrons est sa rapidité quasi instantanée. Elle est souvent utilisée comme stérilisant de surface en raison de la faible capacité de pénétration des particules d'électrons – cependant, avec une énergie suffisante, elle peut elle aussi pénétrer profondément dans la matière.

Les coûts d'exploitation des rayons X, du faisceau d'électrons et des UV peuvent être relativement faibles, chacun de ces procédés se caractérisant par une utilisation efficace de l'électricité. Les équipements à rayons X, à faisceau d'électrons et gamma présentent un coût d'investissement initial élevé [10]. La stérilisation par rayons gamma entraîne un coût récurrent lié au remplacement de sa source de rayonnement, généralement l'isotope cobalt 60. Il convient toutefois de reconnaître que, si les opérateurs doivent toujours être protégés contre les effets nocifs de tous les stérilisants à rayonnement, la présence physique de matières radioactives dans les stérilisateurs gamma implique que des précautions supplémentaires doivent être prises lors de la maintenance de l'appareil.    

Chimiques

Les agents stérilisants chimiques englobent une large gamme de liquides et de gaz ayant une caractéristique commune : leur capacité à détruire la vie microbienne. En raison de ces caractéristiques, ils sont souvent nocifs pour l'homme, voire mortels. L'agent stérilisant chimique le plus couramment utilisé – l'oxyde d'éthylène – peut provoquer à court terme des maux de tête, des nausées, des vomissements, de la diarrhée, un essoufflement, une irritation respiratoire, des lésions pulmonaires et une cyanose, tandis qu'une exposition à long terme est associée à l'apparition de cancers, à des modifications mutagènes, à une neurotoxicité et à une sensibilisation [11]. 

L'oxyde d'éthylène stérilise par alkylation des protéines, de l'ADN et de l'ARN, ce qui rend les micro-organismes non viables [7]. Ce processus résulte de la forte réactivité du composé, une caractéristique qui entraîne des complications logistiques. En raison de sa toxicité et de son inflammabilité, il est recommandé de stocker l’oxyde d’éthylène dans une unité de stockage indépendante, avec une zone d’isolement d’un rayon de 100 m établie en cas de fuite [12]. 

Comme la plupart des agents stérilisants chimiques, l'oxyde d'éthylène est inefficace contre les prions et peut laisser des résidus sur les surfaces stérilisées. Son temps de stérilisation est également long — entre 2 et 5 heures — et son temps de traitement encore plus long ; souvent plus de 14 heures en raison de l'élimination des vapeurs après stérilisation. Il est toutefois très pénétrant, agit à basse température (entre 29 et 65 °C) et ne réagit pas avec la plupart des plastiques.  

Une autre avancée intéressante dans ce domaine est la stérilisation par plasma gazeux. Le plasma gazeux de peroxyde d’hydrogène est créé en excitant la vapeur de peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un champ électrique, ce qui provoque la formation de radicaux libres qui dénaturent les matériaux biologiques, comme dans le cas de la procédure par rayonnement ionisant. Le plasma de peroxyde d'hydrogène s'est révélé efficace contre les prions, fonctionne à basse température (37-44 °C) et a une durée de cycle inférieure à 75 minutes [13]. Cependant, ce procédé a une faible capacité de pénétration et le peroxyde d'hydrogène sur lequel il repose est une substance toxique et explosive.

Chaleur

La stérilisation thermique est le type de stérilisation le plus ancien et le plus simple ; elle se présente sous deux formes : à sec et à la vapeur. Parmi les principaux avantages de la stérilisation thermique, on peut citer sa capacité à détruire toute matière biologique (y compris les prions), sans laisser de contaminants ni de résidus [14]. Un autre avantage est son faible coût, notamment en ce qui concerne les consommables : au maximum, seuls de l'électricité et de l'eau sont nécessaires. Les risques liés à la stérilisation thermique sont également faibles, bien qu'il existe un risque de brûlures en cas de contact avec des objets stérilisés chauds. 

La stérilisation par la chaleur agit d'abord sur les surfaces externes de l'objet stérilisé, puis se propage vers l'intérieur jusqu'à ce que l'ensemble du matériau soit stérilisé. La chaleur dénature les protéines présentes dans les micro-organismes et les matières biologiques, et comme les prions sont des protéines, ils sont également affectés par la stérilisation thermique. Le processus de dénaturation modifie les liaisons hydrogène et disulfure, ainsi que les ponts salins, et altère la structure secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines, les rendant inaptes aux processus biologiques [15].

La stérilisation par chaleur sèche consiste à créer un environnement à une température comprise entre 160 °C et 170 °C et à le maintenir pendant deux à quatre heures. Cette combinaison de temps et de température rend impossible la stérilisation de matériaux sensibles à la chaleur, tels que les plastiques, par cette méthode sans dégradation du matériau [16]. Les lames ont traditionnellement été stérilisées à la chaleur sèche, car on craint que la vapeur ne les émousse. Cependant, des études ont montré que les lames en acier inoxydable stérilisées à la vapeur ne présentent qu'un émoussement négligeable [17].

La stérilisation à la vapeur est un processus plus rapide et moins intensif en chaleur que la stérilisation à la chaleur sèche. La vapeur transfère l'énergie thermique plus efficacement que l'air chaud, ce qui signifie qu'une température plus basse (121 °C – 134 °C) et un temps plus court (3 à 15 minutes) peuvent être utilisés pour la stérilisation. Le point d'ébullition de l'eau à la pression atmosphérique est de 100 °C, ce qui est une température trop basse pour le processus de stérilisation. La vapeur doit donc être générée dans une atmosphère sous pression, ce qui élève le point d'ébullition de l'eau à la température requise. 

Les objets pouvant supporter une chaleur de 134 °C ou moins peuvent être stérilisés à la vapeur, mais doivent être capables de résister à une combinaison de température, d’humidité et de pression. Pour ceux qui le peuvent, la stérilisation à la vapeur constitue une méthode de stérilisation très efficace et pénétrante.

Résumé

La conclusion finale en matière de stérilisation n'est pas simple. Mais il est possible de s'y retrouver dans ces complexités et de trouver la bonne option en se concentrant principalement sur les objets en question et l'état requis après stérilisation.

La filtration constitue une excellente option pour la stérilisation d'un nombre limité de fluides, en particulier ceux sensibles à la chaleur, aux rayonnements et à la stérilisation chimique. Mais les décisions doivent être prises en sachant que cette méthode repose sur d'autres formes de stérilisation pour inactiver les micro-organismes.

Couvrant de multiples variantes avec différentes capacités de pénétration, le rayonnement est une bonne option si les matériaux sont sensibles à la chaleur et peuvent résister à ses effets néfastes. Cependant, sa mise en place est coûteuse et sa rentabilité dépend de l'échelle d'utilisation.

La stérilisation chimique, bien que soulevant des problèmes de toxicité, de résidus et de logistique, ainsi que des coûts de consommables récurrents, a son rôle à jouer lorsque l'objet à stériliser est incompatible avec d'autres techniques de stérilisation – par exemple un matériau solide sensible à la chaleur et aux rayonnements.

Pour les objets qui ne sont pas sensibles à la chaleur, à l'humidité et — dans une certaine mesure — à la pression, la stérilisation à la vapeur s'impose souvent comme le choix de prédilection ; elle offre en effet un bon rapport coût-efficacité, une grande efficacité et une rapidité d'exécution. C'est également le cas pour les déchets, dont l'état après stérilisation n'est pas un sujet de préoccupation. Ainsi, l'autoclave reste un équipement indispensable pour la quasi-totalité des laboratoires, tandis que les systèmes de décontamination des effluents chauffés à la vapeur (EDS) constituent une excellente option pour ceux qui doivent éliminer des déchets liquides biologiquement actifs. Contactez Astell Scientific via Info@Astell.com si vous souhaitez obtenir plus d'informations sur la stérilisation thermique à la vapeur.  

L'analyse du matériau à stériliser permet de déterminer la technique de stérilisation la mieux adaptée au modèle idéal. La combinaison de la rapidité, de l'efficacité, de la compatibilité avec le matériau, de la non-toxicité, de l'adaptabilité et de la possibilité de surveillance peut être évaluée en fonction de la situation requise, parallèlement à la capacité à surmonter toute résistance que pourrait présenter le matériau cible. Bien entendu, la rentabilité sera un facteur clé pour la plupart des organisations.

Références

1. Schneider, P. (1994). Alternatives de stérilisation à basse température dans les années 1990. Tappi Journal ; (États-Unis), 77(1).

2. Rutala, William A., et David J. Weber. « Efficacité clinique des technologies de stérilisation à basse température ». Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998) : 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo ; Ostrowski, Martin (juin 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Consulté le 26 septembre 2017.

4. Duda, V ; Suzina, N ; Polivtseva, V ; Boronin, A (2012). « Ultramicrobactéries : formation du concept et contribution des ultramicrobactéries à la biologie ». Microbiology. 81 (4) : 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter ; Schuhmann, Alexandra ; Mörschel, Erhard ; Rainey, Frederick (avril 1997). « Nouvelles ultramicrobactéries anaérobies appartenant à la lignée bactérienne des Verrucomicrobiales, isolées par culture par dilution à partir de sol de rizière anoxique ». Microbiologie appliquée et environnementale. 63 (4) : 1382-1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Risques liés à l'utilisation de la stérilisation par rayonnement gamma : le revers de la médaille. Int J Med Sci. 2018 ; 15(3) : 274-279. Publié le 18 janvier 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell et Connor, J. (2011). Stérilisation des biomatériaux d'origine synthétique et biologique. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Lignes directrices pour la désinfection et la stérilisation des instruments médicaux contaminés par des prions. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inactivation de l'infectiosité des prions par les rayons ionisants. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Tendances futures pour la stérilisation des biomatériaux et des dispositifs médicaux. Dans Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (pp. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Département du travail des États-Unis, 2020. Oxyde d'éthylène. [en ligne] Administration de la sécurité et de la santé au travail. Disponible à l'adresse : [Consulté le 25 septembre 2020].

12. Centre national d'information sur les biotechnologies (2020). Résumé du composé PubChem pour le CID 6354, oxyde d'éthylène. Consulté le 23 septembre 2020 sur https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Plasma de peroxyde d'hydrogène | Directives de désinfection et de stérilisation | Bibliothèque des directives | Contrôle des infections. Consulté le 27 septembre 2020 sur https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Stérilisation à la vapeur et à la chaleur sèche des biomatériaux et des dispositifs médicaux. Dans Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (pp. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Traitement thermique des protéines alimentaires.

16. Vinny R. Sastri (2014). Exigences relatives aux matériaux pour les plastiques utilisés dans les dispositifs médicaux, dans Plastics in Medical Devices (deuxième édition).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Effet de la stérilisation à la vapeur par rapport à la stérilisation à la chaleur sèche sur l'usure des pinces orthodontiques coupantes. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467-471.

Publié pour la première fois dans Labmate UK & Ireland, volume 45, numéro 7.