Obținerea asepsiei – Alegerea unei proceduri de sterilizare.

Sterilizarea microorganismelor și a materialului biologic este o condiție prealabilă atât pentru controlul experimental, cât și pentru cel de mediu în laboratoarele din numeroase discipline. 

Fie că este vorba de asigurarea condițiilor aseptice într-o placă de cultură sau de menținerea unei zone de bioconținere, scopul sterilizării este întotdeauna eradicarea agenților biologici nedoriți. Acest obiectiv poate fi atins prin diverse proceduri, fiecare având propriile avantaje și dezavantaje.

Procesul ideal de sterilizare trebuie să funcționeze rapid și eficient, dezactivând microorganismele și materialul biologic nedorit, precum prionii. De asemenea, acesta ar trebui să asigure un nivel minim de toxicitate, riscuri minime pentru sănătatea operatorilor și modificări minime ale obiectelor sterilizate, oferind în același timp o adaptabilitate maximă — fiind compatibil cu diverse materiale. Procedura ar trebui, de asemenea, să poată depăși orice rezistență fizică la sterilizare manifestată de materialele supuse sterilizării. În mod ideal, toate acestea ar trebui realizate într-un mod eficient din punct de vedere al costurilor, ceea ce permite, de asemenea, o monitorizare consecventă [1] [2]. 

Îndeplinirea tuturor acestor condiții este însă adesea imposibilă din punct de vedere practic. În consecință, integrarea multora dintre acești factori reprezintă adesea o preocupare secundară, în funcție de situație și de necesitate, obiectivul principal fiind obținerea asepsiei într-un produs final funcțional. În continuare este prezentată o evaluare a metodelor de sterilizare disponibile în mod obișnuit, precum și a avantajelor și dezavantajelor acestora.

Filtrarea sterilă

Dacă se dorește sterilizarea unui material fluid, filtrarea reprezintă o opțiune demnă de luat în considerare. Un lichid sau un gaz poate fi trecut printr-o membrană de filtrare sterilizantă, care formează o barieră mecanică împotriva tuturor particulelor cu un diametru mai mare decât porii membranei. Microorganismele mai mari decât porii sunt reținute în spatele filtrului, asigurându-se astfel că nu pot pătrunde în filtrat. 

Căldura, radiațiile și agenții de sterilizare chimici acționează prin modificarea structurilor fizice ale moleculelor și organitelor din interiorul microorganismelor – un proces care poate modifica și componentele structurale ale substanțelor mai sensibile. Filtrarea nu are astfel de efecte, ci doar îndepărtează particulele care depășesc o anumită dimensiune. Prin urmare, filtrarea reprezintă o alegere plauzibilă pentru fluidele mai instabile și mai reactive.

Deosebit de alte metode de sterilizare, filtrarea nu dezactivează entitățile microbiologice. Prin urmare, sunt necesare alte proceduri de sterilizare – adesea căldură sau radiații – pentru a steriliza filtrul și reziduurile după procesare.

De asemenea, trebuie acordată o atenție deosebită dimensiunii porilor din filtru. Frecvent, se utilizează o dimensiune a porilor de 0,2 μm — iar având în vedere că cea mai mică micoplasmă măsoară aproximativ 0,3 μm — aceasta este suficientă pentru a filtra majoritatea bacteriilor. Cu toate acestea, ultramicobacteriile pot avea dimensiuni mai mici de 0,1 μm [3] [4] [5], în timp ce virusurile și prionii sunt adesea și mai mici. Reducerea dimensiunilor porilor la 0,001 μm asigură că un număr mai mic de entități microbiologice pot pătrunde în filtrat, deși acest lucru devine din ce în ce mai dificil de realizat pentru fluidele care pot fi filtrate. O scădere a dimensiunilor porilor crește, de asemenea, timpul de procesare – un filtru cu pori de 0,1 μm va avea un debit de aproximativ 40% din cel al unui filtru cu pori de 0,2 μm.

Radiațiile

Ca agent de sterilizare, radiația ia multiple forme. Agenții de sterilizare cu radiații ionizante, inclusiv razele X, razele gamma și fasciculele de electroni, sterilizează prin excitarea electromagnetică a particulelor din zona care urmează să fie sterilizată, determinându-le să elibereze radicali liberi. Acești radicali se combină cu legăturile duble din biomolecule (cum ar fi ADN-ul, ARN-ul și enzimele), modificându-le forma, oprindu-le funcționarea și ducând la inactivarea microorganismelor care le conțin. Sterilizanții cu radiații neionizante acționează prin formarea de noi legături – dimeri de pirimidină – între bazele nucleice din ADN, ceea ce – la fel ca în cazul radiațiilor ionizante – modifică structura macromoleculei și îi oprește funcționarea. 

Datorită funcționalității lor, agenții de sterilizare prin radiații pot degrada substanțele chimice organice, cum ar fi materialele plastice [6] [7] și materialul biologic. Din păcate, efectele lor degradante nu se extind la prioni, care rămân în mare parte prea stabili pentru a fi afectați de agenții de sterilizare prin radiații. [8] Cu toate acestea, merită menționat faptul că unele studii indică posibilitatea denaturării prionilor prin radiații gamma [9]. 

Un alt aspect important este faptul că capacitatea de penetrare și timpii de tratare ai agenților de sterilizare prin radiații variază semnificativ.  Lumina ultravioletă (UV) poate pătrunde doar prin materiale transparente, ceea ce o face un agent de sterilizare viabil pentru aer și apă purificată prin osmoză inversă, dar se limitează la o sterilizare de suprafață în cazul substanțelor opace. Durata de procesare a razelor UV poate ajunge, de asemenea, la câteva ore, la fel ca în cazul razelor X și al radiațiilor gamma. Cu toate acestea, aceste două din urmă metode prezintă propriile avantaje. 

Razele gamma și razele X au o putere de penetrare ridicată, ceea ce înseamnă că pot fi utilizate pentru sterilizarea obiectelor aflate în recipiente care, în alte condiții, ar fi impermeabile. Principalul avantaj al sterilizării cu fascicul de electroni este sterilizarea aproape instantanee. Adesea, aceasta este utilizată ca agent de sterilizare de suprafață din cauza capacității reduse de penetrare a particulelor de electroni – însă, cu suficientă energie, poate pătrunde și ea adânc în materie.

Costurile de funcționare pentru razele X, fasciculul de electroni și radiațiile UV pot fi relativ scăzute, fiecare dintre acestea caracterizându-se printr-o utilizare eficientă a energiei electrice. Echipamentele pentru raze X, fascicul de electroni și raze gamma au un cost inițial ridicat [10]. Sterilizarea cu raze gamma implică un cost continuu asociat cu înlocuirea sursei de radiație, de obicei izotopul cobalt-60. Trebuie însă recunoscut faptul că, deși operatorii trebuie să fie întotdeauna protejați de efectele dăunătoare ale tuturor agenților de sterilizare prin radiații, prezența fizică a materialului radioactiv în sterilizatoarele cu raze gamma înseamnă că trebuie luate măsuri de precauție suplimentare în timpul întreținerii dispozitivului.    

Chimice

Agenții de sterilizare chimici cuprind o gamă largă de lichide și gaze cu o caracteristică comună – capacitatea lor de a distruge viața microbiană. Datorită acestor caracteristici, aceștia sunt adesea nocivi pentru oameni, dacă nu chiar letali. Cel mai frecvent utilizat agent chimic de sterilizare – oxidul de etilenă – poate provoca, pe termen scurt, dureri de cap, greață, vărsături, diaree, dificultăți de respirație, iritații respiratorii, leziuni pulmonare și cianoză, în timp ce expunerea pe termen lung este asociată cu apariția cancerului, modificări mutagene, neurotoxicitate și sensibilizare [11]. 

Oxidul de etilenă sterilizează prin alchilarea proteinelor, a ADN-ului și a ARN-ului, ceea ce face ca microorganismele să devină neviabile [7]. Acest proces are loc ca urmare a reactivității ridicate a compusului; o caracteristică care duce la complicații logistice. Datorită combinației dintre toxicitatea și inflamabilitatea sa, se recomandă ca oxidul de etilenă să fie depozitat într-o unitate de depozitare separată — cu o zonă de izolare cu o rază de 100 m stabilită în caz de scurgere [12]. 

La fel ca în cazul majorității agenților chimici de sterilizare, oxidul de etilenă este ineficient împotriva prionilor și poate lăsa reziduuri pe suprafețele sterilizate. Durata de sterilizare este, de asemenea, îndelungată – între 2 și 5 ore –, iar timpul de procesare este și mai lung; adesea depășește 14 ore din cauza eliminării vaporilor după sterilizare. Cu toate acestea, are o putere de penetrare ridicată, acționează la temperaturi scăzute (între 29 și 65 °C) și nu reacționează cu majoritatea materialelor plastice.  

O altă evoluție semnificativă în domeniu este sterilizarea cu plasmă gazoasă. Plasma gazoasă de peroxid de hidrogen se generează prin excitarea vaporilor de peroxid de hidrogen cu ajutorul unui câmp electric, determinându-i să elibereze radicali liberi care denaturează materialele biologice, similar procedurii cu radiații ionizante. S-a demonstrat că plasma gazoasă de peroxid de hidrogen este eficientă împotriva prionilor, funcționează la temperaturi scăzute (37–44 °C) și are o durată a ciclului de mai puțin de 75 de minute [13]. Cu toate acestea, procesul are o capacitate de penetrare redusă, iar peroxidul de hidrogen pe care se bazează este o substanță toxică și explozivă.

Căldura

Sterilizarea termică este cea mai veche și mai simplă metodă de sterilizare și se prezintă sub două forme – uscată și cu abur. Printre principalele avantaje ale sterilizării termice se numără capacitatea sa de a distruge toate materialele biologice (inclusiv prionii), fără a lăsa în urmă contaminanți sau reziduuri [14]. Un alt avantaj îl reprezintă costul redus, în special în ceea ce privește consumabilele: cel mult, sunt necesare doar energie electrică și apă. Riscurile asociate sterilizării termice sunt, de asemenea, reduse, deși există riscul de arsuri în cazul atingerii obiectelor sterilizate fierbinți. 

Sterilizarea termică acționează mai întâi asupra suprafețelor exterioare ale obiectului sterilizat, apoi se propagă spre interior până când întregul material a fost sterilizat. Căldura denaturează proteinele prezente în microorganisme și în materialul biologic, iar deoarece prionii sunt proteine, aceștia sunt, de asemenea, afectați de sterilizarea termică. Procesul de denaturare modifică legăturile de hidrogen și disulf, precum și punțile de sare, și alterează structura secundară, terțiară și cuaternară a proteinelor, făcându-le inapte pentru procesele biologice [15].

Sterilizarea cu căldură uscată presupune crearea unui mediu cu temperaturi cuprinse între 160 °C și 170 °C și menținerea acestuia timp de 2–4 ore. Această combinație de timp și temperatură face ca sterilizarea materialelor sensibile la căldură, precum plasticul, prin această metodă să fie imposibilă fără degradarea materialului [16]. Lamele au fost sterilizate tradițional cu căldură uscată, deoarece există îngrijorări cu privire la faptul că aburul le-ar putea toci. Cu toate acestea, studiile au arătat că lamele din oțel inoxidabil sterilizate cu abur prezintă o tocare neglijabilă [17].

Sterilizarea cu abur este un proces mai rapid și care necesită mai puțină căldură decât sterilizarea cu căldură uscată. Aburul transferă energia termică mai eficient decât aerul cald, ceea ce înseamnă că pentru sterilizare se pot utiliza o temperatură mai scăzută (121 °C – 134 °C) și un timp mai scurt (3 până la 15 minute). Punctul de fierbere al apei la presiune atmosferică este de 100 °C, temperatură prea scăzută pentru procesul de sterilizare. Prin urmare, aburul trebuie generat într-o atmosferă sub presiune, ceea ce ridică punctul de fierbere al apei la temperatura necesară. 

Obiectele care pot suporta o temperatura de 134 °C sau mai mica pot fi sterilizate cu abur, dar trebuie sa poata rezista la o combinatie de temperatura, umiditate si presiune. Pentru cele care pot face acest lucru, sterilizarea cu abur reprezinta o metoda extrem de eficienta si cu penetrare profunda.

Rezumat

Concluzia finală privind sterilizarea nu este simplă. Totuși, este posibil să ne orientăm printre complexități și să găsim opțiunea potrivită, concentrându-ne în principal pe obiectele în cauză și pe starea necesară a acestora după sterilizare.

Filtrarea reprezintă o opțiune excelentă pentru sterilizarea unui număr limitat de fluide – în special a celor sensibile la căldură, radiații și sterilizare chimică. Totuși, deciziile trebuie luate ținând cont de faptul că această metodă se bazează pe alte forme de sterilizare pentru a inactiva microorganismele prin mecanismul său.

Cuprinzând multiple variante cu capacități de penetrare diferite, radiațiile reprezintă o opțiune bună dacă materialele sunt sensibile la căldură și pot rezista efectelor lor dăunătoare. Cu toate acestea, instalarea este costisitoare, iar rentabilitatea depinde de amploarea utilizării.

Sterilizarea chimică, deși implică probleme legate de toxicitate, reziduuri și aspecte logistice, precum și costuri continue cu consumabilele, își are rolul său atunci când obiectul care urmează să fie sterilizat este incompatibil cu alte tehnici de sterilizare – de exemplu, un material solid sensibil la căldură și radiații.

Pentru obiectele care nu sunt sensibile la căldură, umiditate și — într-o anumită măsură — la presiune, sterilizarea cu abur reprezintă adesea alegerea optimă, oferind rentabilitate, eficacitate și rapiditate. Aceasta este și situația deșeurilor, pentru care starea lor post-sterilizare nu reprezintă o preocupare. Prin urmare, autoclavul rămâne un echipament esențial pentru aproape toate laboratoarele, în timp ce sistemele de decontaminare a efluenților prin încălzire cu abur (EDS) oferă o opțiune excelentă pentru cei care trebuie să elimine deșeuri lichide biologic active. Contactați Astell Scientific la adresa Info@Astell.com dacă aveți nevoie de mai multe informații despre sterilizarea termică cu abur.  

Prin analiza materialului care urmează să fie sterilizat, este posibil să se identifice o tehnică de sterilizare care se potrivește cel mai bine modelului ideal. O combinație de viteză, eficacitate, compatibilitate cu materialul, non-toxicitate, adaptabilitate și capacitatea de monitorizare poate fi evaluată pentru situația respectivă, alături de capacitatea de a depăși orice rezistență a materialului țintă. Desigur, raportul cost-eficiență va fi un factor cheie în majoritatea organizațiilor.

Referințe

1. Schneider, P. (1994). Alternative de sterilizare la temperatură scăzută în anii 1990. Tappi Journal; (Statele Unite), 77(1).

2. Rutala, William A. și David J. Weber. „Eficacitatea clinică a tehnologiilor de sterilizare la temperatură scăzută.” Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (iunie 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Accesat la 26 septembrie 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). „Ultramicrobacteriile: formarea conceptului și contribuția ultramicrobacteriilor la biologie”. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (aprilie 1997). „Ultramicrobacterii anaerobi noi, aparținând liniei evolutive Verrucomicrobiales, izolați prin cultură de diluție din solul anoxic al câmpurilor de orez”. Microbiologie aplicată și de mediu. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Riscurile utilizării sterilizării prin radiații gamma: cealaltă față a monedei. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Publicat la 18 ianuarie 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell și Connor, J. (2011). Sterilizarea biomaterialelor de origine sintetică și biologică. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J. și Societatea Americană de Epidemiologie în Sănătate. (2010). Ghid pentru dezinfectarea și sterilizarea instrumentelor medicale contaminate cu prioni. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inactivarea infectivității prionice prin raze ionizante. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Tendințe viitoare în sterilizarea biomaterialelor și a dispozitivelor medicale. În Sterilizarea biomaterialelor și a dispozitivelor medicale (pp. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Departamentul Muncii al Statelor Unite, 2020. Oxid de etilenă. [online] Administrația pentru Sănătate și Securitate în Muncă. Disponibil la: [Accesat la 25 septembrie 2020].

12. Centrul Național pentru Informații Biotehnologice (2020). Rezumatul compusului PubChem pentru CID 6354, oxid de etilenă. Preluat la 23 septembrie 2020 de la https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Plasma de peroxid de hidrogen gazos | Ghiduri de dezinfecție și sterilizare | Biblioteca de ghiduri | Controlul infecțiilor. Accesat la 27 septembrie 2020, de la https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilizarea cu abur și căldură uscată a biomaterialelor și dispozitivelor medicale. În Sterilizarea biomaterialelor și dispozitivelor medicale (pp. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Tratamentul termic al proteinelor alimentare.

16. Vinny R. Sastri (2014). Cerințe privind materialele pentru materialele plastice utilizate în dispozitivele medicale, în „Materialele plastice în dispozitivele medicale” (ediția a doua).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Efectul sterilizării cu abur comparativ cu cel al sterilizării cu căldură uscată asupra uzurii cleștilor ortodontici de tăiere a ligaturilor. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467-471.

Publicat inițial în Labmate UK & Ireland, volumul 45, numărul 7.