Oppnåelse av aseptiske forhold – valg av steriliseringsmetode.

Sterilisering av mikroorganismer og biologisk materiale er en forutsetning for både eksperimentell kontroll og miljøkontroll i laboratorier innen en lang rekke fagområder. 

Uansett om det gjelder å sikre aseptiske forhold i en dyrkningsplate eller opprettholde et område med biologisk inneslutning, er målet med sterilisering alltid å utrydde uønskede biologiske agenser. Dette målet kan oppnås gjennom en rekke ulike prosedyrer, hver med sine egne fordeler og ulemper.

Den ideelle steriliseringen må være rask og effektiv, og deaktivere mikroorganismer og uønsket biologisk materiale, som prioner. Den bør også sikre minimal toksisitet, minimale helserisikoer for operatører og minimale endringer i de steriliserte gjenstandene, samtidig som den gir maksimal tilpasningsevne – ved å kunne håndtere ulike materialer. Prosedyren bør også kunne overvinne eventuell fysisk motstand mot sterilisering som de materialene som skal steriliseres viser. Alt dette bør ideelt sett oppnås på en kostnadseffektiv måte, som også muliggjør kontinuerlig overvåking [1] [2]. 

Det er imidlertid ofte upraktisk å oppfylle alle disse vilkårene. Følgelig blir det å innlemme mange av disse faktorene ofte et sekundært hensyn avhengig av situasjon og nødvendighet, der hovedmålet er å oppnå aseptiske forhold i et funksjonelt sluttprodukt. Det følgende er en vurdering av vanlige steriliseringsmetoder, samt deres fordeler og ulemper.

Sterilfiltrering

Ved sterilisering av flytende materialer er filtrering et alternativ å vurdere. En væske eller gass kan ledes gjennom en steriliserende filtermembran som danner en mekanisk barriere mot alle partikler med større diameter enn porene i membranen. Mikroorganismer som er større enn porene blir fanget bak filteret, noe som sikrer at de ikke kan komme inn i filtratet. 

Varme, stråling og kjemiske steriliseringsmidler virker ved å endre de fysiske strukturene til molekyler og organeller i mikroorganismer – en prosess som også kan endre de strukturelle komponentene i mer følsomme stoffer. Filtrering har ikke slike effekter, men fjerner kun partikler over en viss størrelse. Dermed utgjør filtrering et fornuftig valg for mer ustabile og reaktive væsker.

I motsetning til andre steriliseringsmetoder deaktiverer filtrering ikke mikrobiologiske enheter. Derfor er det nødvendig med andre steriliseringsprosedyrer – ofte varme eller stråling – for å sterilisere filteret og restmaterialet etter behandlingen.

Man må også være svært oppmerksom på porestørrelsen i filteret. Ofte benyttes en porestørrelse på 0,2 μm – og siden den minste mykoplasmaen måler rundt 0,3 μm – er dette tilstrekkelig for å filtrere bort de fleste bakterier. Ultramikrobakterier kan imidlertid måle mindre enn 0,1 μm [3] [4] [5], mens virus og prioner ofte er enda mindre. Å redusere porestørrelsen til 0,001 μm sikrer at færre mikrobiologiske enheter kan trenge inn i filtratet, selv om dette i stadig større grad begrenser hvilke væsker som kan filtreres. En reduksjon i porestørrelsen øker også behandlingstiden – et filter med 0,1 μm porestørrelse vil ha rundt 40 % av strømningshastigheten til et filter med 0,2 μm porestørrelse.

Stråling

Som steriliseringsmiddel finnes stråling i flere former. Ta for eksempel ioniserende stråling, som inkluderer røntgenstråler, gammastråler og elektronstråler. Disse teknologiene steriliserer ved å elektromagnetisk stimulere partikler i området som skal steriliseres, slik at de frigjør frie radikaler. Disse radikalene binder seg til dobbeltbindingene i biomolekyler (som DNA, RNA og enzymer), endrer deres form, hindrer deres funksjon og fører til at mikroorganismene som inneholder dem blir inaktive. Ikke-ioniserende strålingssteriliseringsmidler virker ved å få nye bindinger – pyrimidindimere – til å danne seg mellom nukleobasene i DNA, noe som – i likhet med ioniserende stråling – endrer makromolekylets struktur og hindrer det i å fungere. 

På grunn av sin virkemåte kan strålingssteriliseringsmidler nedbryte organiske kjemikalier som plast [6] [7] og biologisk materiale. Dessverre omfatter deres nedbrytende virkning ikke prioner, som i stor grad forblir for stabile til å påvirkes av strålingssteriliseringsmidler. [8] Det er imidlertid verdt å merke seg at enkelte studier viser en mulighet for denaturering av prioner ved hjelp av gammastråling [9]. 

En annen viktig faktor er at strålingssterilisatorers gjennomtrengningsevne og behandlingstider varierer betydelig.  Ultraviolett lys (UV) kan bare trenge gjennom gjennomsiktige materialer, noe som gjør det til et brukbart steriliseringsmiddel for luft og renset omvendt osmosevann, men det er begrenset til overflatesterilisering av ugjennomsiktige stoffer. Behandlingstiden for UV-stråling kan også ta flere timer, slik tilfellet er med røntgenstråler og gammastråling. De to sistnevnte metodene har imidlertid sine egne fordeler. 

Gammastråling og røntgenstråler har svært høy gjennomtrengningsevne, noe som betyr at de kan brukes til å sterilisere gjenstander som befinner seg i ellers ugjennomtrengelige beholdere. Elektronstråle-sterilisering utmerker seg ved å kunne sterilisere nærmest øyeblikkelig. Ofte brukes den som et overflatesteriliseringsmiddel på grunn av elektronpartiklenes dårlige gjennomtrengningsevne – men med tilstrekkelig energi kan også den trenge dypt inn i materialet.

Driftskostnadene for røntgenstråling, elektronstråling og UV-stråling kan være relativt lave, og effektivt strømforbruk er et kjennetegn ved alle tre. Utstyr for røntgenstråling, elektronstråling og gammastråling har imidlertid høye oppstartskostnader [10]. Gammastrålingssterilisering medfører løpende kostnader knyttet til utskifting av strålekilden, vanligvis isotopen kobolt-60. Det bør imidlertid påpekes at selv om operatører alltid bør beskyttes mot de skadelige effektene av alle strålingssteriliseringsmetoder, innebærer den fysiske tilstedeværelsen av radioaktivt materiale i gammastrålingssterilisatorer at det må tas ekstra forholdsregler under vedlikehold av utstyret.    

Kjemisk

Kjemiske steriliseringsmidler omfatter et bredt spekter av væsker og gasser med ett felles trekk – deres evne til å ødelegge mikrobielt liv. På grunn av disse egenskapene er de ofte skadelige for mennesker, om ikke dødelige. Det mest brukte kjemiske steriliseringsmiddelet – etylenoksid – kan på kort sikt forårsake hodepine, kvalme, oppkast, diaré, kortpustethet, irritasjon i luftveiene, lungeskade og cyanose, mens langvarig eksponering er forbundet med forekomst av kreft, mutagene forandringer, nevrotoksisitet og sensibilisering [11]. 

Etylenoksidgass steriliserer gjennom alkylering av proteiner, DNA og RNA, noe som gjør mikroorganismer ikke-levedyktige [7]. Denne prosessen skjer som følge av forbindelsens høye reaktivitet – en egenskap som medfører logistiske utfordringer. På grunn av en kombinasjon av giftighet og brannfarlighet anbefales det at etylenoksid oppbevares i et frittstående lager – med en isolasjonssone på 100 meter i radius etablert i tilfelle lekkasje [12]. 

Som de fleste kjemiske steriliseringsmidler er etylenoksid ineffektivt mot prioner og kan etterlate rester på steriliserte overflater. Steriliseringstiden er også lang – mellom 2 og 5 timer – og behandlingstiden enda lengre; ofte over 14 timer på grunn av fjerning av damp etter sterilisering. Likevel har det svært god gjennomtrengningsevne, virker ved lave temperaturer (mellom 29–65 °C) og reagerer ikke med de fleste plasttyper.  

En annen interessant utvikling på dette området er gassplasmasterilisering. Hydrogenperoksidgassplasma dannes ved å eksitere hydrogenperoksiddamp ved hjelp av et elektrisk felt, noe som får den til å avgi frie radikaler som denaturerer biologisk materiale, på samme måte som ved prosedyren med ioniserende stråling. Hydrogenperoksidgassplasma har vist seg å være effektivt mot prioner, fungerer ved lave temperaturer (37–44 °C) og har en syklustid på under 75 minutter [13]. Prosessen har imidlertid begrenset gjennomtrengningsevne, og hydrogenperoksidet den er avhengig av, er et giftig og eksplosivt stoff.

Varme

Varmesterilisering er den eldste og enkleste formen for sterilisering, og forekommer i to former – tørr og med damp. Sentrale fordeler ved varmesterilisering er blant annet dens evne til å ødelegge alt biologisk materiale (inkludert prioner), uten å etterlate forurensninger eller rester [14]. En annen fordel er de lave kostnadene, spesielt når det gjelder forbruksvarer: det kreves høyst bare strøm og vann. Farene knyttet til varmesterilisering er også små, selv om det er fare for brannskader ved berøring av varme, steriliserte gjenstander. 

Varmesterilisering påvirker først overflatene på gjenstanden som skal steriliseres, og sprer seg deretter innover til hele materialet er sterilisert. Varme denaturerer proteinene som finnes i mikroorganismer og biologisk materiale, og siden prioner er proteiner, påvirkes også de av varmesterilisering. Denatureringsprosessen endrer hydrogen- og disulfidbindinger samt saltbroer, og endrer proteiners sekundære, tertiære og kvartære struktur, noe som gjør dem ubrukelige for biologiske prosesser [15].

Sterilisering med tørr varme innebærer å skape et miljø med en temperatur på 160 °C til 170 °C og opprettholde denne i mellom to og fire timer. Denne kombinasjonen av tid og temperatur gjør at sterilisering av varmefølsomt materiale, som plast, ved hjelp av denne metoden ikke er gjennomførbart uten at materialet brytes ned [16]. Kniver har tradisjonelt blitt sterilisert med tørr varme, da det er bekymring for at damp kan gjøre dem sløve. Studier har imidlertid vist at kniver av rustfritt stål som er sterilisert med damp, viser ubetydelig sløving [17].

Dampsterilisering er en raskere og mindre varmeintensiv prosess enn sterilisering med tørr varme. Damp overfører varmeenergi mer effektivt enn varm luft, noe som betyr at man kan bruke en lavere temperatur (121 °C–134 °C) og kortere tid (3 til 15 minutter) til sterilisering. Vannets kokepunkt ved atmosfæretrykk er 100 °C, noe som er for lav temperatur for steriliseringsprosessen. Derfor må damp genereres i et trykkmiljø, noe som hever vannets kokepunkt til den nødvendige temperaturen. 

Gjenstander som tåler en temperatur på 134 °C eller mindre, kan steriliseres med damp, men må kunne tåle en kombinasjon av temperatur, fuktighet og trykk. For de som tåler dette, er dampsterilisering en svært effektiv og gjennomtrengende steriliseringsmetode.

Oppsummering

Den endelige konklusjonen når det gjelder sterilisering er ikke entydig. Men det er mulig å finne veien gjennom kompleksiteten og finne det riktige alternativet ved å holde et sterkt fokus på de aktuelle gjenstandene og den tilstanden de må være i etter steriliseringen.

Filtrering er et egnet alternativ for sterilisering av begrensede volum væsker, spesielt følsomme for varme, stråling og kjemisk sterilisering. Metoden må imidlertid kombineres med andre metoder for å deaktivere mikroorganismer fullstendig.

Stråling, som omfatter flere varianter med ulik gjennomtrengningsevne, er et godt alternativ hvis materialene er varmefølsomme og tåler strålingens skadelige virkninger. Imidlertid er det kostbart å sette opp, og det må brukes i stor skala for å være kostnadseffektivt.

Kjemisk sterilisering, selv om den er forbundet med toksisitet, reststoffer og logistiske utfordringer, samt løpende kostnader til forbruksvarer, har sin rolle å spille når gjenstanden som skal steriliseres er uforenlig med andre steriliseringsteknikker – for eksempel et fast materiale som er følsomt for varme og stråling.

For gjenstander som ikke er følsomme for varme, fuktighet og – til en viss grad – trykk, vil dampsterilisering ofte fremstå som det beste valget, da den tilbyr kostnadseffektivitet, effektivitet og hastighet. Dette gjelder også for avfallsmaterialer, der tilstanden etter sterilisering ikke er av betydning. Derfor er en autoklav fortsatt uunnværlig utstyr for nesten alle laboratorier, mens dampoppvarmede avløpsdekontamineringssystemer (EDS) utgjør et utmerket alternativ for de som har biologisk aktivt flytende avfall å avhende. Kontakt Astell Scientific via Info@Astell.com hvis du trenger mer informasjon om dampbasert varmesterilisering.  

Gjennom analyse av materialet som skal steriliseres, er det mulig å finne en steriliseringsteknikk som passer best til den ideelle modellen. En kombinasjon av hastighet, effektivitet, materialkompatibilitet, giftfrihet, tilpasningsevne og muligheten for overvåking kan alle vurderes for den aktuelle situasjonen, sammen med evnen til å overvinne eventuell materialmotstand som kan forekomme i målmaterialet. Kostnadseffektivitet vil selvfølgelig være en nøkkelfaktor i de fleste organisasjoner.

Referanser

1. Schneider, P. (1994). Alternativer for lavtemperatursterilisering på 1990-tallet. Tappi Journal; (USA), 77(1).

2. Rutala, William A., og David J. Weber. «Klinisk effektivitet av lavtemperatursteriliseringsteknologier.» Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (juni 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Hentet 26. september 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). «Ultramikrobakterier: Begrepsdannelse og ultramikrobakteriers bidrag til biologien». Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (april 1997). «Nye anaerobe ultramikrobakterier tilhørende verrucomicrobiales-stammen, isolert ved fortynningskultur fra anoksisk risåkerjord». Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Risikoer ved bruk av sterilisering med gammastråling: Den andre siden av mynten. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Publisert 18. januar 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell og Connor, J. (2011). Sterilisering av biomaterialer av syntetisk og biologisk opprinnelse. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Retningslinjer for desinfeksjon og sterilisering av prionforurensede medisinske instrumenter. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inaktivering av prioninfektivitet ved hjelp av ioniserende stråling. Radiation Physics and Chemistry, 76(11–12), 1760–1762.

10. Simmons, A. (2012). Fremtidige trender for sterilisering av biomaterialer og medisinsk utstyr. I Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 310–320). Woodhead Publishing.

11. USAs arbeidsdepartement, 2020. Etylenoksid. [online] Arbeidsmiljøetaten (Occupational Safety and Health Administration). Tilgjengelig på: [Hentet 25. september 2020].

12. National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem-sammendrag for CID 6354, etylenoksid. Hentet 23. september 2020 fra https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Hydrogenperoksidgassplasma | Retningslinjer for desinfeksjon og sterilisering | Retningslinjebibliotek | Infeksjonskontroll. Hentet 27. september 2020 fra https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilisering av biomaterialer og medisinsk utstyr med damp og tørr varme. I Sterilisering av biomaterialer og medisinsk utstyr (s. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN | Varmebehandling av matproteiner.

16. Vinny R. Sastri (2014). Materialkrav til plast brukt i medisinsk utstyr, i Plastics in Medical Devices (andre utgave).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Effekten av sterilisering med damp sammenlignet med tørrvarme på slitasjen av kjeveortopediske ligaturklippetenger. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, 121(5), 467–471.

Først publisert i Labmate UK & Ireland, bind 45, utgave 7.