Alcançar a assepsia — Escolher um procedimento de esterilização.

A esterilização de organismos microbianos e de material biológico constitui um pré-requisito tanto para o controlo experimental como para o controlo ambiental em laboratórios de inúmeras disciplinas. 

Quer se trate de garantir condições assépticas numa placa de cultura ou de manter uma área de biocontenção, o objetivo da esterilização é sempre a erradicação de agentes biológicos indesejados. Este objetivo pode ser alcançado através de uma variedade de procedimentos, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens.

O processo de esterilização ideal deve funcionar de forma rápida e eficaz, inativando microrganismos e material biológico indesejado, como os prions. Deve também garantir toxicidade mínima, riscos mínimos para a saúde dos operadores e alterações mínimas nos objetos esterilizados, ao mesmo tempo que proporciona a máxima adaptabilidade — acomodando diferentes materiais. O procedimento deve ainda ser capaz de superar qualquer resistência física à esterilização demonstrada pelos materiais a esterilizar. Idealmente, tudo isto deve ser alcançado de forma economicamente eficiente, permitindo igualmente uma monitorização consistente [1] [2]. 

No entanto, cumprir todas estas condições é frequentemente impraticável. Consequentemente, a integração de muitos destes fatores é muitas vezes uma preocupação secundária, dependendo da situação e da necessidade, sendo o objetivo principal alcançar a assepsia num produto final funcional. Segue-se uma avaliação dos métodos de esterilização comummente disponíveis, bem como das suas vantagens e desvantagens.

Filtração Estéril

Quando se pretende esterilizar um material fluido, a filtração é uma opção a considerar. Um líquido ou gás pode ser feito passar através de uma membrana filtrante esterilizante, que forma uma barreira mecânica a todas as partículas de diâmetro superior ao dos poros da membrana. Os microrganismos maiores do que os poros ficam retidos atrás do filtro, garantindo que não possam entrar no filtrado. 

O calor, a radiação e os esterilizantes químicos atuam alterando as estruturas físicas das moléculas e das organelas no interior dos microrganismos — um processo que também pode alterar os componentes estruturais de substâncias mais sensíveis. A filtração não tem tais efeitos, limitando-se a remover partículas acima de um determinado tamanho. Como tal, a filtração constitui uma escolha plausível para fluidos mais instáveis e reativos.

Ao contrário de outros métodos de esterilização, a filtração não inativa as entidades microbiológicas. Como tal, são necessários outros procedimentos de esterilização — frequentemente calor ou radiação — para esterilizar o filtro e os resíduos após o processamento.

Deve também ser prestada especial atenção ao tamanho dos poros do filtro. Frequentemente, utiliza-se um tamanho de poro de 0,2 μm — e, dado que o micoplasma mais pequeno mede cerca de 0,3 μm —, isto é suficiente para filtrar a maioria das bactérias. No entanto, as ultramicobactérias podem medir menos de 0,1 μm [3] [4] [5], enquanto os vírus e os priões são frequentemente ainda mais pequenos. A redução do tamanho dos poros para 0,001 μm garante que menos entidades microbiológicas possam entrar no filtrado, embora tal se torne cada vez mais proibitivo para os fluidos que podem ser filtrados. Uma diminuição do tamanho dos poros também aumenta o tempo de processamento — um filtro com poros de 0,1 μm terá cerca de 40 % da vazão de um filtro com poros de 0,2 μm.

Radiação

Enquanto agente esterilizante, a radiação assume múltiplas formas. Tomemos, por exemplo, os agentes esterilizantes por radiação ionizante, incluindo raios X, raios gama e feixes de eletrões. Estas tecnologias esterilizam através da excitação eletromagnética de partículas na área a ser esterilizada, levando-as a libertar radicais livres. Estes radicais combinam-se com as ligações duplas nas biomoléculas (tais como o ADN, o ARN e as enzimas), alterando a sua forma, impedindo o seu funcionamento e levando à inatividade dos microrganismos que as contêm. Os esterilizantes por radiação não ionizante atuam provocando a formação de novas ligações — dímeros de pirimidina — entre as bases nucleicas do ADN, o que — tal como acontece com a radiação ionizante — altera a estrutura da macromolécula e impede o seu funcionamento. 

Devido à sua funcionalidade, os esterilizantes por radiação podem degradar substâncias químicas orgânicas, tais como plásticos [6] [7] e material biológico. Infelizmente, os seus efeitos degradativos não se estendem aos priões, que permanecem, em grande medida, demasiado estáveis para serem afetados pelos esterilizantes por radiação. [8] No entanto, vale a pena referir que alguns estudos apontam para a possibilidade de desnaturação dos priões através da radiação gama [9]. 

Outra consideração importante é que a capacidade de penetração e os tempos de processamento dos esterilizantes por radiação variam significativamente.  A luz ultravioleta (UV) só é capaz de penetrar em materiais transparentes, o que a torna um esterilizante viável para o ar e para a água purificada por osmose inversa, mas limita-se a ser um esterilizante de superfície para substâncias opacas. O tempo de processamento da luz UV também pode demorar horas, tal como acontece com os raios X e a radiação gama. No entanto, estes dois últimos métodos apresentam as suas próprias vantagens. 

Os raios gama e os raios X são altamente penetrantes, o que significa que podem ser utilizados para esterilizar objetos contidos em recipientes que, de outra forma, seriam impermeáveis. A principal vantagem da esterilização por feixe de eletrões é a esterilização quase instantânea. Frequentemente, é utilizada como esterilizante de superfície devido à fraca capacidade de penetração das partículas de eletrões — no entanto, com energia suficiente, também pode penetrar profundamente na matéria.

Os custos operacionais dos raios X, do feixe de eletrões e dos raios UV tendem a ser relativamente baixos, dado o seu elevado grau de eficiência energética. O equipamento de raios X, feixe de eletrões e raios gama apresenta um elevado custo de capital inicial [10]. A esterilização por raios gama implica um custo contínuo associado à substituição da sua fonte de radiação, normalmente o isótopo cobalto-60. Deve, no entanto, reconhecer-se que, embora os operadores devam estar sempre protegidos dos efeitos nocivos de todos os esterilizantes por radiação, a presença física de material radioativo nos esterilizadores por raios gama implica que devem ser tomadas precauções adicionais durante a manutenção do dispositivo.    

Química

Os esterilizantes químicos abrangem uma vasta gama de líquidos e gases com uma característica comum: a sua capacidade de destruir a vida microbiana. Devido a estas características, são frequentemente nocivos para os seres humanos, podendo mesmo ser mortais. O agente de esterilização químico mais utilizado — o óxido de etileno — pode causar dores de cabeça, náuseas, vómitos, diarreia, falta de ar, irritação respiratória, lesões pulmonares e cianose a curto prazo, enquanto a exposição a longo prazo está associada à ocorrência de cancro, alterações mutagénicas, neurotoxicidade e sensibilização [11]. 

O gás óxido de etileno esteriliza através da alquilação de proteínas, ADN e ARN, o que torna os microrganismos inviáveis [7]. Este processo decorre da elevada reatividade do composto, característica que acarreta complicações logísticas. Devido à combinação da sua toxicidade e inflamabilidade, recomenda-se que o óxido de etileno seja armazenado numa unidade de armazenamento independente — com uma zona de isolamento de 100 m de raio estabelecida para o caso de uma fuga [12]. 

Tal como acontece com a maioria dos esterilizantes químicos, o óxido de etileno é ineficaz contra os priões e pode deixar resíduos nas superfícies esterilizadas. O seu tempo de esterilização é também prolongado — entre 2 e 5 horas — e o seu tempo de processamento ainda mais longo; frequentemente superior a 14 horas, devido à remoção do vapor após a esterilização. No entanto, é altamente penetrante, funciona a baixas temperaturas (entre 29 e 65 °C) e não reage com a maioria dos plásticos.  

Outro avanço interessante nesta área é a esterilização por plasma gasoso. O plasma gasoso de peróxido de hidrogénio é criado através da excitação do vapor de peróxido de hidrogénio por meio de um campo elétrico, o que faz com que este libere radicais livres que desnaturam os materiais biológicos, tal como acontece no procedimento de radiação ionizante. O plasma de gás de peróxido de hidrogénio revelou-se eficaz contra os priões, funciona a baixas temperaturas (37–44 °C) e tem um tempo de ciclo inferior a 75 minutos [13]. No entanto, o processo apresenta fraca capacidade de penetração e o peróxido de hidrogénio de que depende é uma substância tóxica e explosiva.

Calor

A esterilização por calor é o método mais antigo e simples, apresentando-se em duas formas: a seco e a vapor. Entre as principais vantagens da esterilização por calor contam-se a sua capacidade de destruir todo o material biológico (incluindo priões), sem deixar contaminantes nem resíduos [14]. Outra vantagem é o baixo custo operacional, uma vez que são necessários apenas eletricidade e água. Os riscos associados são reduzidos, embora se recomende precaução para evitar queimaduras ao manusear objetos recém-esterilizados. 

A esterilização por calor atua primeiro nas superfícies externas do objeto a ser esterilizado, espalhando-se depois para o interior até que todo o material tenha sido esterilizado. O calor desnatura as proteínas presentes nos microrganismos e no material biológico e, uma vez que os priões são proteínas, são também afetados pela esterilização por calor. O processo de desnaturação altera as ligações de hidrogénio e dissulfureto, bem como as pontes salinas, e altera a estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas, tornando-as inválidas para processos biológicos [15].

A esterilização por calor seco envolve a criação de um ambiente com temperaturas entre 160 °C e 170 °C e a sua manutenção durante um período de duas a quatro horas. Esta combinação de tempo e temperatura significa que a esterilização de materiais sensíveis ao calor, tais como os plásticos, através deste método, não é viável sem que ocorra degradação do material [16]. As lâminas têm sido tradicionalmente esterilizadas com calor seco, uma vez que existem receios de que o vapor as possa embotar. No entanto, estudos demonstraram que as lâminas de aço inoxidável esterilizadas com vapor apresentam um embotamento insignificante [17].

A esterilização a vapor é um processo mais rápido e que requer menos calor do que a esterilização por calor seco. O vapor transfere energia térmica de forma mais eficaz do que o ar quente, o que significa que é possível utilizar uma temperatura mais baixa (121 °C – 134 °C) e um período de tempo mais curto (3 a 15 minutos) para a esterilização. O ponto de ebulição da água à pressão atmosférica é de 100 °C, o que constitui uma temperatura demasiado baixa para o processo de esterilização. Como tal, o vapor tem de ser gerado numa atmosfera pressurizada, o que eleva o ponto de ebulição da água até à temperatura necessária. 

Os objetos que suportam uma temperatura de 134 °C ou inferior podem ser esterilizados com vapor, mas têm de ser capazes de resistir a uma combinação de temperatura, humidade e pressão. Para aqueles que o conseguem, a esterilização a vapor constitui uma forma de esterilização altamente eficaz e de grande penetração.

Resumo

A conclusão final sobre a esterilização não é simples. No entanto, é possível orientar-se entre as complexidades e encontrar a opção certa, mantendo o foco principal nos objetos em questão e nas condições exigidas após a esterilização.

A filtração é uma opção adequada para quem esteriliza um número limitado de fluidos — especialmente aqueles sensíveis ao calor, à radiação e à esterilização química. No entanto, as decisões devem ser tomadas tendo em conta que este método depende de outras formas de esterilização para inativar os microrganismos através do seu mecanismo.

Abrangendo múltiplas variantes com diferentes capacidades de penetração, a radiação constitui uma boa opção se os materiais forem sensíveis ao calor e puderem suportar os seus efeitos nocivos. No entanto, a sua implementação é dispendiosa e depende da escala de utilização para se revelar rentável.

A esterilização química, embora apresente preocupações relacionadas com a toxicidade, resíduos e logística, para além de custos contínuos com consumíveis, tem o seu papel a desempenhar quando o objeto a ser esterilizado é incompatível com outras técnicas de esterilização — por exemplo, um material sólido sensível ao calor e à radiação.

Para objetos que não sejam sensíveis ao calor, à humidade e — em certa medida — à pressão, a esterilização a vapor surge frequentemente como a escolha mais adequada, oferecendo rentabilidade, eficácia e rapidez. O mesmo se aplica aos resíduos, cujo estado após a esterilização não constitui motivo de preocupação. Como tal, a autoclave continua a ser um equipamento essencial para quase todos os laboratórios, enquanto os sistemas de descontaminação de efluentes aquecidos a vapor (EDS) constituem uma excelente opção para quem necessita de eliminar resíduos líquidos biologicamente ativos. Contacte a Astell Scientific através do endereço Info@Astell.com caso necessite de mais informações sobre a esterilização térmica a vapor.  

Através da análise do material a ser esterilizado, é possível identificar a técnica de esterilização que melhor se adequa ao modelo ideal. Uma combinação de rapidez, eficácia, compatibilidade com o material, não toxicidade, adaptabilidade e capacidade de monitorização pode ser avaliada para a situação em questão, a par da capacidade de superar qualquer resistência que possa ser encontrada no material em causa. Naturalmente, a relação custo-benefício será um fator determinante na maioria das organizações.

Referências

1. Schneider, P. (1994). Alternativas de esterilização a baixa temperatura na década de 1990. Tappi Journal; (Estados Unidos), 77(1).

2. Rutala, William A., e David J. Weber. «Eficácia clínica das tecnologias de esterilização a baixa temperatura.» Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (junho de 2003). Enciclopédia das Ciências da Vida. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Consultada em 26 de setembro de 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). «Ultramicrobactérias: Formação do Conceito e Contribuição das Ultramicrobactérias para a Biologia». Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (abril de 1997). «Novas ultramicrobactérias anaeróbicas pertencentes à linhagem Verrucomicrobiales, isoladas por cultura de diluição a partir de solo anóxico de arrozais». Microbiologia Aplicada e Ambiental. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Riscos da utilização da esterilização por radiação gama: o outro lado da moeda. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Publicado a 18 de janeiro de 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell e Connor, J. (2011). Esterilização de biomateriais de origem sintética e biológica. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Sociedade Americana de Epidemiologia na Área da Saúde. (2010). Orientações para a desinfeção e esterilização de instrumentos médicos contaminados com priões. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inativação da infecciosidade dos priões por raios ionizantes. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Tendências futuras para a esterilização de biomateriais e dispositivos médicos. Em Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (pp. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Departamento do Trabalho dos Estados Unidos, 2020. Óxido de etileno. [online] Administração de Segurança e Saúde no Trabalho. Disponível em: [Consultado em 25 de setembro de 2020].

12. Centro Nacional de Informação Biotecnológica (2020). Resumo do composto PubChem para o CID 6354, óxido de etileno. Recuperado em 23 de setembro de 2020, de https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide.

13. Cdc.gov (2020) Plasma de gás de peróxido de hidrogénio | Orientações de Desinfeção e Esterilização | Biblioteca de Orientações | Controlo de Infecções. Consultado em 27 de setembro de 2020, em https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Esterilização por vapor e calor seco de biomateriais e dispositivos médicos. Em Esterilização de Biomateriais e Dispositivos Médicos (pp. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Tratamento térmico de proteínas alimentares.

16. Vinny R. Sastri (2014). Requisitos dos materiais plásticos utilizados em dispositivos médicos, em «Plásticos em Dispositivos Médicos» (2.ª edição).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Efeito da esterilização a vapor versus a calor seco no desgaste de alicates ortodônticos para corte de ligaduras. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, 121(5), 467-471.

Publicado pela primeira vez na revista «Labmate UK & Ireland», Volume 45, Número 7.