Досягнення асептичних умов — вибір методу стерилізації.

Стерилізація мікроорганізмів та біологічного матеріалу є необхідною умовою як експериментального, так і екологічного контролю в лабораторіях різних галузей науки. 

Незалежно від того, чи йдеться про забезпечення асептичних умов у культуральній чашці, чи про підтримку зони біологічної ізоляції, метою стерилізації завжди є знищення небажаних біологічних агентів. Цю мету можна досягти за допомогою різноманітних процедурних методів, кожен із яких має свої переваги та недоліки.

Оптимальний процес стерилізації має бути швидким та ефективним, деактивуючи мікроорганізми та небажані біологічні матеріали, такі як пріони. Він також має забезпечувати мінімальну токсичність, мінімальні ризики для здоров’я операторів та мінімальні зміни у стерилізованих об’єктах, водночас забезпечуючи максимальну адаптивність — пристосовуючись до різних матеріалів. Процедура також має бути здатною подолати будь-який фізичний опір стерилізації, який виявляють матеріали, що піддаються стерилізації. Усе це, в ідеалі, має бути досягнуто економічно ефективним способом, що також дозволяє здійснювати постійний моніторинг [1] [2]. 

Однак дотримання всіх цих умов часто є нереальним. Отже, врахування багатьох із цих факторів часто відходить на другий план залежно від ситуації та необхідності, а головною метою залишається досягнення асептичності у функціональному кінцевому продукті. Далі наведено оцінку загальнодоступних методів стерилізації, їхніх переваг та недоліків.

Стерильна фільтрація

Якщо необхідно стерилізувати рідкий матеріал, слід розглянути варіант фільтрації. Рідину або газ можна пропускати через стерилізуючу фільтрувальну мембрану, яка утворює механічний бар’єр для всіх частинок, діаметр яких перевищує розмір пор у мембрані. Мікроорганізми, розмір яких перевищує розмір пор, затримуються за фільтром, що гарантує неможливість їх потрапляння у фільтрат. 

Тепло, радіація та хімічні стерилізатори діють шляхом зміни фізичної структури молекул та органел у мікроорганізмах — процес, який також може змінити структурні компоненти більш чутливих речовин. Фільтрація не має таких ефектів, а лише видаляє частинки, розмір яких перевищує певну межу. Таким чином, фільтрація є обґрунтованим вибором для більш нестабільних та реактивних рідин.

На відміну від інших методів стерилізації, фільтрація не інактивує мікробіологічні об’єкти. Тому для стерилізації фільтра та залишків після обробки необхідні інші процедури стерилізації — найчастіше теплова або радіаційна.

Окрім того, слід ретельно контролювати розміри пор у фільтрі. Найчастіше використовується пористість 0,2 мкм — з огляду на те, що найменша мікоплазма має розміри близько 0,3 мкм, цього достатньо для затримання більшості бактерій. Однак ультрамікобактерії можуть мати розміри менше 0,1 мкм [3] [4] [5], тоді як віруси та пріони ще менші. Зменшення розміру пор до 0,001 мкм гарантує, що до фільтрату потраплятиме менше мікробіологічних об’єктів, хоча це все більше обмежує перелік рідин, які можна фільтрувати. Зменшення розміру пор також збільшує час обробки — фільтр із порами розміром 0,1 мкм матиме приблизно 40 % пропускної здатності фільтра з порами розміром 0,2 мкм.

Радіація

Як стерилізуючий засіб радіація має різні форми. Іонізуючі стерилізатори, такі як рентгенівські промені, гамма-промені та електронні пучки, здійснюють стерилізацію шляхом електромагнітного збудження частинок у зоні обробки, змушуючи їх вивільняти вільні радикали. Ці радикали з’єднуються з подвійними зв’язками в біомолекулах (таких як ДНК, РНК та ферменти), змінюючи їхню форму, зупиняючи їхню функцію та призводячи до втрати життєздатності мікроорганізмів, що їх містять. Неіонізуючі радіаційні стерилізатори діють шляхом утворення нових зв’язків — піримідинових димерів — між нуклеотидними основами в ДНК, що — як і в разі іонізуючого випромінювання — змінює структуру макромолекули та зупиняє її функціонування. 

Завдяки своїй дії стерилізатори, що використовують випромінювання, можуть розкладати органічні хімічні речовини, такі як пластмаси [6] [7], та біологічний матеріал. На жаль, їхній деградаційний ефект не поширюється на пріони, які залишаються надто стабільними, щоб на них впливали стерилізатори, що використовують випромінювання [8]. Однак варто зазначити, що деякі дослідження вказують на можливість денатурації пріонів під дією гамма-випромінювання [9]. 

Ще одним важливим аспектом є те, що проникаюча здатність та час обробки стерилізуючих засобів, що використовують випромінювання, значно різняться.  Ультрафіолетове випромінювання (УФ) проникає лише через прозорі матеріали, що робить його придатним для стерилізації повітря та очищеної води, отриманої методом зворотного осмосу, але для непрозорих речовин воно обмежується поверхневою стерилізацією. Час обробки УФ-випромінюванням також може тривати годинами, як і у випадку з рентгенівським та гамма-випромінюванням. Однак ці два останні методи мають свої переваги. 

Гамма- та рентгенівське випромінювання мають високу проникаючу здатність, що дозволяє використовувати їх для стерилізації предметів, що знаходяться в інакше непроникних контейнерах. Головна перевага стерилізації електронним променем — практично миттєва стерилізація. Зазвичай її використовують як засіб поверхневої стерилізації через низьку проникаючу здатність електронних частинок, однак за умови достатньої енергії вона також може глибоко проникати в речовину.

Експлуатаційні витрати на рентгенівське, електронно-променеве та УФ-обпромінення можуть бути відносно низькими, оскільки всі ці методи характеризуються ефективним використанням електроенергії. Початкові капітальні витрати на обладнання для рентгенівського, електронно-променевого та гамма-обпромінення є високими [10]. Гамма-стерилізація пов’язана з постійними витратами на заміну джерела випромінювання, яким зазвичай є ізотоп кобальту-60. Однак слід враховувати, що, хоча операторів завжди слід захищати від шкідливого впливу всіх видів радіаційної стерилізації, фізична присутність радіоактивного матеріалу в гамма-стерилізаторах означає необхідність дотримання додаткових запобіжних заходів під час технічного обслуговування пристрою.    

Хімічні

Хімічні стерилізатори охоплюють широкий спектр рідин та газів, об’єднаних однією спільною рисою — здатністю знищувати мікроорганізми. Завдяки цим властивостям вони часто є шкідливими для людей, а то й смертельними. Найпоширеніший хімічний стерилізатор — етиленоксид — може спричиняти головний біль, нудоту, блювоту, діарею, задишку, подразнення дихальних шляхів, ураження легень та ціаноз у короткостроковій перспективі, тоді як тривалий вплив пов’язаний із виникненням раку, мутагенних змін, нейротоксичності та сенсибілізації [11]. 

Етиленоксид стерилізує шляхом алкілування білків, ДНК та РНК, що призводить до втрати життєздатності мікроорганізмів [7]. Цей процес зумовлений високою реакційною здатністю сполуки, що також створює логістичні ускладнення. Через поєднання токсичності та горючості етиленоксиду його рекомендується зберігати в окремому сховищі з ізоляційною зоною радіусом 100 м на випадок витоку [12]. 

Як і більшість хімічних стерилізаторів, етиленоксид неефективний проти пріонів і може залишати залишки на стерилізованих поверхнях. Тривалість стерилізації також є значною — від 2 до 5 годин, — а час обробки ще довший; часто він перевищує 14 годин через необхідність видалення парів після стерилізації. Проте він має високу проникаючу здатність, діє при низьких температурах (від 29 до 65 °C) і не вступає в реакцію з більшістю пластиків.  

Ще одним перспективним напрямком є стерилізація газовою плазмою. Газова плазма перекису водню утворюється шляхом збудження парів перекису водню в електричному полі, що призводить до утворення вільних радикалів, які денатурують біологічні матеріали, як і при процедурі іонізуючого випромінювання. Доведено, що газова плазма перекису водню ефективна проти пріонів, працює при низьких температурах (37–44 °C) і має тривалість циклу менше 75 хвилин [13]. Однак цей процес має низьку проникаючу здатність, а перекис водню, на якому він базується, є токсичною вибухонебезпечною речовиною.

Термічна стерилізація

Термічна стерилізація — найдавніший і найпростіший вид стерилізації, який має дві форми — суху та парову. До основних переваг термічної стерилізації належить її здатність знищувати всі біологічні матеріали (включно з пріонами), не залишаючи при цьому жодних забруднювачів чи залишків [14]. Ще однією перевагою є низька вартість, особливо щодо витратних матеріалів: як максимум, потрібні лише електроенергія та вода. Небезпека, пов’язана з тепловою стерилізацією, також є низькою, хоча існує ризик опіків при дотику до гарячих стерилізованих предметів. 

Теплова стерилізація спочатку впливає на зовнішні поверхні об’єкта, що стерилізується, а потім поширюється всередину, доки весь матеріал не буде стерилізовано. Тепло денатурує білки, що містяться в мікроорганізмах та біологічному матеріалі, і оскільки пріони є білками, на них також впливає стерилізація теплом. Процес денатурації змінює водневі та дисульфідні зв’язки, а також сольові містки, і змінює вторинну, третинну та четвертинну структуру білків, роблячи їх непридатними для біологічних процесів [15].

Стерилізація сухим теплом передбачає створення середовища з температурою від 160 °C до 170 °C та підтримання її протягом 2–4 годин. Таке поєднання часу та температури унеможливлює стерилізацію теплочутливих матеріалів, таких як пластик, без погіршення їхніх властивостей [16]. Леза традиційно стерилізують сухим теплом через побоювання, що пара може призвести до їхнього затуплення. Однак дослідження показали, що леза з нержавіючої сталі, стерилізовані парою, демонструють незначне затуплення [17].

Стерилізація парою є швидшим і менш теплоємним процесом, ніж стерилізація сухим теплом. Пара передає теплову енергію ефективніше, ніж гаряче повітря, що дозволяє використовувати нижчу температуру (121–134 °C) та коротший час (3–15 хв) для стерилізації. Температура кипіння води за атмосферного тиску становить 100 °C, що є занадто низькою температурою для процесу стерилізації. Тому пар необхідно утворювати в умовах підвищеного тиску, що підвищує температуру кипіння води до необхідного рівня. 

Обладнання, яке витримує температуру 134 °C або нижчу, можна стерилізувати парою, але воно повинно витримувати поєднання температури, вологи та тиску. Для таких матеріалів стерилізація парою є високоефективним методом стерилізації з глибоким проникненням.

Висновки

Остаточний висновок щодо стерилізації не є однозначним. Однак можна розібратися у всіх складнощах і знайти правильний варіант, зосередившись на конкретних предметах та необхідному стані, якого вони мають досягти після стерилізації.

Фільтрація є ефективним методом стерилізації обмеженої кількості рідин, особливо чутливих до нагрівання, опромінення та хімічної стерилізації. Однак слід враховувати, що для інактивації мікроорганізмів цей метод потребує комбінації з іншими видами стерилізації.

Радіаційна стерилізація, що охоплює численні варіанти з різною здатністю проникнення, є хорошим вибором, якщо матеріали чутливі до тепла та здатні витримати її шкідливий вплив. Однак її впровадження є дорогим, а економічна ефективність залежить від масштабів її застосування.

Хімічна стерилізація, незважаючи на токсичність, залишки реагентів, логістичні виклики та постійні витрати на витратні матеріали, може бути обґрунтованим вибором, коли об’єкт несумісний з іншими методами — наприклад, твердий матеріал, чутливий до тепла та радіації.

Для об’єктів, що нечутливі до тепла, вологи та певної міри тиску, стерилізація парою часто є оптимальним вибором, забезпечуючи економічну ефективність, результативність та швидкість. Це також стосується відходів, стан яких після стерилізації не має значення. Таким чином, автоклав залишається незамінним обладнанням для більшості лабораторій, тоді як системи деконтамінації стоків із паровим нагріванням (EDS) є ефективним рішенням для утилізації біологічно активних рідких відходів. Зверніться до компанії Astell Scientific за адресою Info@Astell.com, якщо вам потрібна додаткова інформація про стерилізацію теплом за допомогою пари.  

Аналіз матеріалу, що підлягає стерилізації, дозволяє обрати метод, який найкраще відповідає ідеальній моделі. Для конкретної ситуації можна оцінити поєднання швидкості, ефективності, сумісності з матеріалом, нетоксичності, адаптивності та можливості контролю, а також здатність подолати будь-яку стійкість, яка може бути виявлена у матеріалі, що підлягає обробці. Звичайно, економічна ефективність буде ключовим фактором для більшості організацій.

Література

1. Шнайдер, П. (1994). Альтернативні методи низькотемпературної стерилізації у 1990-х роках. Tappi Journal; (США), 77(1).

2. Рутала, Вільям А. та Девід Дж. Вебер. «Клінічна ефективність технологій низькотемпературної стерилізації». Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Кавіччіолі, Рікардо; Островський, Мартін (червень 2003). «Енциклопедія наук про життя». Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Переглянуто 26 вересня 2017 року.

4. Дуда, В.; Сузіна, Н.; Полівцева, В.; Боронін, А. (2012). «Ультрамікробактерії: формування концепції та внесок ультрамікробактерій у біологію». Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Янссен, Петер; Шуманн, Александра; Мёршель, Ерхард; Рейни, Фредерік (квітень 1997). «Нові анаеробні ультрамікробактерії, що належать до лінійки Verrucomicrobiales бактеріального походження, виділені методом розведення культур із бескисневого ґрунту рисових полів». Прикладна та екологічна мікробіологія. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Ризики використання стерилізації гамма-випромінюванням: інша сторона медалі. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Опубліковано 18 січня 2018 р. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Цю, Ц.-Ц., Сун, Венделл та Коннор, Дж. (2011). Стерилізація біоматеріалів синтетичного та біологічного походження. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Рутала, В. А., Вебер, Д. Дж. та Американське товариство епідеміології в охороні здоров’я. (2010). Керівництво щодо дезінфекції та стерилізації медичних інструментів, забруднених пріонами. «Infect Control Hosp Epidemiol», 31(2), 107–17.

9. Гоміне, М., Вадро, С., Острі, Г., та Дарборд, Ж. К. (2007). Інактивація інфекційності пріонів за допомогою іонізуючого випромінювання. «Радіаційна фізика та хімія», 76(11–12), 1760–1762.

10. Сіммонс, А. (2012). Майбутні тенденції у стерилізації біоматеріалів та медичних виробів. У збірнику «Стерилізація біоматеріалів та медичних виробів» (с. 310–320). Видавництво Woodhead Publishing.

11. Міністерство праці США, 2020. Етиленоксид. [онлайн] Адміністрація з питань безпеки та гігієни праці. Доступно за адресою: [Переглянуто 25 вересня 2020 р.].

12. Національний центр біотехнологічної інформації (2020). Резюме сполуки PubChem для CID 6354, етиленоксид. Отримано 23 вересня 2020 року з https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Газова плазма перекису водню | Керівні принципи дезінфекції та стерилізації | Бібліотека керівних принципів | Інфекційний контроль. Отримано 27 вересня 2020 року з https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Стерилізація біоматеріалів та медичних виробів парою та сухим теплом. У книзі «Стерилізація біоматеріалів та медичних виробів» (с. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Мауер, Л. (2003). ПРОТЕЇН | Термічна обробка харчових білків.

16. Вінні Р. Састрі (2014). Вимоги до матеріалів для пластиків, що використовуються у медичних виробах, у книзі «Пластики у медичних виробах» (друге видання).

17. Вендрелл, Р. Дж., Хейден, К. Л., та Талуміс, Л. Дж. (2002). Вплив стерилізації парою порівняно з сухим теплом на зношування ортодонтичних плоскогубців для обрізання лігатур. «Американський журнал ортодонтії та дентально-лицевої ортопедії», 121(5), 467–471.

Вперше опубліковано в журналі «Labmate UK & Ireland», том 45, випуск 7.