Se abre la puerta de la cámara y se introducen en ella las canastas llenas de los artículos que requieren esterilización.

El autoclave activa el calentador, que eleva la temperatura del agua y genera vapor. Se abre la válvula de escape, permitiendo que el vapor expulse el aire de la cámara a través de la salida de escape.

Una vez que se ha expulsado todo el aire de la cámara, se cierra la válvula de escape. En este momento, el vapor generado no tiene por dónde escapar, lo que provoca un aumento de la presión dentro de la cámara.
A medida que la presión aumenta, el vapor ejerce fuerza sobre el agua, obligando a las moléculas de agua a absorber más energía térmica para convertirse en vapor. A medida que el agua continúa calentándose, se produce vapor a temperaturas superiores a 100 °C.
Cuando la temperatura supera los 121 °C, los artículos dentro de la cámara comienzan a someterse a la esterilización. A esta temperatura, la esterilización requiere un mínimo de 15 minutos. A temperaturas más altas, el proceso de esterilización es más rápido.

A medida que la cámara se enfría, la presión interna desciende hasta igualarse con la del ambiente externo. Una vez completado el enfriamiento, se puede abrir la puerta de la cámara de manera segura y se pueden retirar los artículos esterilizados.