A porta da câmara é aberta e os cestos cheios de artigos que necessitam de esterilização são colocados na câmara.

O autoclave ativa o aquecedor, que eleva a temperatura da água e gera vapor. A válvula de escape abre-se, permitindo que o vapor expulse o ar da câmara e o conduza através da saída de escape.

Assim que todo o ar tiver sido expelido da câmara, a válvula de escape é fechada. Nesta fase, o vapor que está a ser gerado não tem por onde escapar, o que faz com que a pressão no interior da câmara aumente.
À medida que a pressão aumenta, o vapor exerce força sobre a água, obrigando as moléculas de água a absorver mais energia térmica para se transformarem em vapor. À medida que a água continua a ser aquecida, é produzido vapor a temperaturas superiores a 100 °C.
Quando a temperatura ultrapassa os 121 °C, os artigos na câmara começam a ser submetidos à esterilização. A esta temperatura, a esterilização requer um mínimo de 15 minutos. A temperaturas mais elevadas, o processo de esterilização é mais rápido.

À medida que a câmara arrefece, a pressão no seu interior diminui para se equiparar à do ambiente exterior. Assim que o arrefecimento estiver concluído, a porta da câmara pode ser aberta com segurança e os artigos esterilizados podem ser removidos.