Cửa buồng được mở ra, và các giỏ chứa các vật phẩm cần tiệt trùng được đưa vào buồng.

Tủ hấp tiệt trùng bật bộ gia nhiệt, làm nóng nước và tạo ra hơi nước. Van xả được mở ra, cho phép hơi nước đẩy không khí ra khỏi buồng và thoát qua cửa xả.

Khi toàn bộ không khí đã được đẩy ra khỏi buồng, van xả sẽ được đóng lại. Lúc này, hơi nước được tạo ra không có lối thoát, khiến áp suất bên trong buồng tăng lên.
Khi áp suất tăng, hơi nước tác động lực lên nước, buộc các phân tử nước phải hấp thụ thêm năng lượng nhiệt để chuyển hóa thành hơi nước. Khi nước tiếp tục được làm nóng, hơi nước sẽ được tạo ra ở nhiệt độ vượt quá 100°C.
Khi nhiệt độ vượt quá 121°C, các vật phẩm trong buồng bắt đầu trải qua quá trình tiệt trùng. Ở nhiệt độ này, quá trình tiệt trùng cần tối thiểu 15 phút. Ở nhiệt độ cao hơn, quá trình tiệt trùng sẽ diễn ra nhanh hơn.

Khi buồng nguội đi, áp suất bên trong sẽ giảm xuống ngang bằng với môi trường bên ngoài. Sau khi quá trình làm mát hoàn tất, cửa buồng có thể được mở một cách an toàn và các vật phẩm đã được tiệt trùng có thể được lấy ra.