A porta da câmara é aberta e as cestas com os itens a esterilizar são colocadas no interior da câmara.

A autoclave liga seu aquecedor, que aquece a água e gera vapor. A válvula de exaustão é aberta, permitindo que o vapor expulse o ar da câmara e o conduza pela saída de exaustão.

Assim que todo o ar tiver sido expelido da câmara, a válvula de exaustão é fechada. Nesse momento, o vapor que está sendo gerado não tem para onde escapar, fazendo com que a pressão dentro da câmara aumente.
À medida que a pressão aumenta, o vapor exerce força sobre a água, obrigando as moléculas de água a absorver mais energia térmica para se converterem em vapor. À medida que a água continua a ser aquecida, o vapor é produzido a temperaturas superiores a 100 °C.
Quando a temperatura ultrapassa 121 °C, os itens na câmara iniciam o processo de esterilização. A essa temperatura, a esterilização requer um tempo mínimo de 15 minutos. Em temperaturas mais elevadas, o processo de esterilização é mais rápido.

À medida que a câmara esfria, a pressão interna diminui para se equiparar à do ambiente externo. Assim que o resfriamento estiver concluído, a porta da câmara pode ser aberta com segurança, e os itens esterilizados podem ser removidos.