Drzwi komory są otwarte, a do komory wkłada się kosze wypełnione przedmiotami wymagającymi sterylizacji.

Autoklaw włącza grzałkę, która podgrzewa wodę i wytwarza parę. Otwiera się zawór wydechowy, co pozwala parze wypchnąć powietrze z komory przez otwór wylotowy.

Po całkowitym usunięciu powietrza z komory zawór wylotowy zostaje zamknięty. W tym momencie wytwarzana para nie ma gdzie uciec, co powoduje wzrost ciśnienia wewnątrz komory.
Wraz ze wzrostem ciśnienia para wywiera nacisk na wodę, zmuszając cząsteczki wody do pochłaniania większej ilości energii cieplnej w celu przekształcenia się w parę. W miarę dalszego podgrzewania wody powstaje para o temperaturze przekraczającej 100°C.
Gdy temperatura przekroczy 121°C, przedmioty znajdujące się w komorze zaczynają podlegać sterylizacji. W tej temperaturze sterylizacja trwa co najmniej 15 minut. W wyższych temperaturach proces sterylizacji przebiega szybciej.

W miarę schładzania się komory ciśnienie wewnątrz spada do poziomu odpowiadającego ciśnieniu otoczenia zewnętrznego. Po zakończeniu schładzania można bezpiecznie otworzyć drzwi komory i wyjąć wysterylizowane przedmioty.