Постигане на асептика – избор на процедура за стерилизация.

Стерилизацията на микроорганизми и биологичен материал е предпоставка както за експериментален, така и за екологичен контрол в лаборатории от най-различни дисциплини. 

Независимо дали става въпрос за осигуряване на асептични условия в културална чашка или за поддържане на зона за биологична изолация, целта на стерилизацията винаги е ликвидирането на нежелани биологични агенти. Тази цел може да бъде постигната чрез различни процедурни методи, всеки от които има свои предимства и недостатъци.

Идеалният процес на стерилизация трябва да действа бързо и ефективно, като деактивира микроорганизмите и нежелания биологичен материал, като например приони. Той трябва също така да гарантира минимална токсичност, рискове за здравето на операторите и промени в стерилизираните обекти, като същевременно осигурява максимална адаптивност — съобразявайки се с различни материали. Процедурата трябва също така да може да преодолее всякаква физическа устойчивост към стерилизация, проявявана от стерилизираните материали. В идеалния случай всичко това трябва да се постигне по икономически ефективен начин, който позволява и постоянен мониторинг [1] [2]. 

Изпълнението на всички тези условия обаче често е непрактично. Следователно включването на много от тези фактори често остава на втори план в зависимост от ситуацията и необходимостта, като основната цел е постигането на асептика във функционалния краен продукт. По-долу следва оценка на широко разпространените методи за стерилизация, както и на техните предимства и недостатъци.

Стерилна филтрация

При необходимост от стерилизация на течен материал, филтрацията е вариант, който заслужава внимание. Течност или газ могат да се прекарат през стерилизираща филтърна мембрана, която образува механична бариера за всички частици с диаметър, по-голям от порите в мембраната. Микроорганизмите, по-големи от порите, се задържат зад филтъра, което гарантира, че те не могат да влязат във филтрата. 

Топлината, радиацията и химическите стерилизатори действат чрез промяна на физическите структури на молекулите и органелите в микроорганизмите – процес, който може да промени и структурните компоненти на по-чувствителни вещества. Филтрацията няма такива ефекти, а само отстранява частиците над определен размер. По този начин филтрацията представлява подходящ избор за по-нестабилни и реактивни течности.

В сравнение с други методи за стерилизация, филтрацията не деактивира микробиологичните образувания. Поради това са необходими допълнителни процедури за стерилизация – обикновено с топлина или радиация – за да се стерилизират филтърът и остатъците след обработката.

Трябва да се обърне специално внимание и на размера на порите във филтъра. Често се използва размер на порите от 0,2 μm — а като се има предвид, че най-малката микоплазма е с размер около 0,3 μm — това е достатъчно за отфилтриране на повечето бактерии. Въпреки това ултрамикобактериите могат да са с размер по-малък от 0,1 μm [3] [4] [5], докато вирусите и прионите често са още по-малки. Намаляването на размера на порите до 0,001 μm гарантира, че по-малко микробиологични частици могат да проникнат във филтрата, въпреки че това все повече ограничава течностите, които могат да бъдат филтрирани. Намаляването на размера на порите също така увеличава времето за обработка – филтър с пори 0,1 μm ще има около 40 % от дебита на филтър с пори 0,2 μm.

Радиация

Като стерилизатор радиацията приема различни форми. Вземете например стерилизаторите с йонизираща радиация, включително рентгенови лъчи, гама лъчи и електронни лъчи. Тези технологии стерилизират чрез електромагнитно възбуждане на частиците в стерилизираната зона, което ги кара да отделят свободни радикали. Тези радикали се свързват с двойните връзки в биомолекулите (като ДНК, РНК и ензими), променят тяхната форма, спират функционирането им и водят до деактивиране на микроорганизмите, които ги съдържат. Стерилизаторите с нейонизиращо лъчение действат, като предизвикват образуването на нови връзки – пиримидинови димери – между нуклеобазите в ДНК, което – подобно на йонизиращото лъчение – променя структурата на макромолекулата и спира нейното функциониране. 

Въпреки това, поради своята функционалност, радиационните стерилизатори могат да разграждат органични химикали като пластмаси [6] [7] и биологичен материал. За съжаление, техните разграждащи ефекти не се простират върху прионите, които остават до голяма степен твърде стабилни, за да бъдат засегнати от радиационните стерилизатори. [8] Въпреки това си заслужава да се отбележи, че някои проучвания показват възможност за денатурация на прионите чрез гама-лъчение [9]. 

Друг важен аспект е, че проникващата способност и времето за обработка на радиационните стерилизатори варират значително.  Ултравиолетовата светлина (UV) може да прониква само през прозрачни материали, което я прави подходящ стерилизатор за въздух и пречистена вода чрез обратна осмоза, но при непрозрачни вещества тя се използва само за повърхностна стерилизация. Времето за обработка с UV също може да отнеме часове, както е случаят с рентгеновите лъчи и гама-лъчите. Тези два последни метода обаче имат свои предимства. 

Гама-лъчите и рентгеновите лъчи имат висока проникваща способност, което означава, че могат да се използват за стерилизация на предмети, намиращи се в иначе непропускливи контейнери. Основното предимство на стерилизацията с електронен лъч е, че тя се извършва почти мигновено. Често тя се използва като средство за повърхностна стерилизация поради слабата проникваща способност на електронните частици – но при достатъчно енергия и тя може да проникне дълбоко в материята.

Експлоатационните разходи за рентгенови лъчи, електронен лъч и ултравиолетови лъчи могат да бъдат относително ниски, като ефективното използване на електроенергия е характерна черта на всеки от тях. Оборудването за рентгенови лъчи, електронен лъч и гама-лъчи има високи начални капиталови разходи [10]. Гама-стерилизацията е свързана с текущи разходи за подмяна на източника на лъчение, обикновено изотопа кобалт-60. Трябва обаче да се отбележи, че макар операторите винаги да трябва да бъдат защитени от вредните ефекти на всички стерилизатори, използващи лъчение, физическото присъствие на радиоактивен материал в гама-стерилизаторите означава, че трябва да се вземат допълнителни предпазни мерки по време на поддръжката на устройството.    

Химически

Химичните стерилизатори обхващат широк спектър от течности и газове с една обща характеристика – способността им да унищожават микроби. Поради тези характеристики те често са вредни за хората, ако не и смъртоносни. Най-често използваният химически стерилизатор – етиленоксидът – може да предизвика главоболие, гадене, повръщане, диария, затруднено дишане, дразнене на дихателните пътища, увреждане на белите дробове и цианоза в краткосрочен план, докато дългосрочното излагане се свързва с появата на рак, мутагенни промени, невротоксичност и сенсибилизация [11]. 

Етиленовият оксид стерилизира чрез алкилиране на протеини, ДНК и РНК, което прави микроорганизмите нежизнеспособни [7]. Този процес протича в резултат на високата реактивност на съединението – свойство, което води до логистични усложнения. Поради комбинацията от токсичност и запалимост се препоръчва етиленовият оксид да се съхранява в отделено съоръжение за съхранение — с установена изолационна зона с радиус 100 м в случай на изтичане [12]. 

Както при повечето химически стерилизатори, етиленовият оксид е неефективен срещу приони и може да оставя остатъци върху стерилизираните повърхности. Времето за стерилизация също е дълго — между 2 и 5 часа — а времето за обработка е дори по-дълго; често над 14 часа поради отстраняването на парите след стерилизацията. Въпреки това, той притежава висока проникваща способност, действа при ниски температури (между 29–65 °C) и не реагира с повечето пластмаси.  

Друго интересно развитие в тази област е стерилизацията с газова плазма. Газовата плазма от водороден пероксид се създава чрез възбуждане на пари от водороден пероксид с помощта на електрическо поле, което води до отделяне на свободни радикали, които денатурират биологичните материали, подобно на процедурата с йонизиращо лъчение. Доказано е, че газовата плазма от водороден пероксид е ефективна срещу приони, работи при ниски температури (37–44 °C) и има продължителност на цикъла по-малко от 75 минути [13]. Процесът обаче има слаби проникващи способности, а водородният пероксид, на който разчита, е токсично и взривоопасно вещество.

Топлина

Стерилизацията с топлина е най-старият и най-простият вид стерилизация и се извършва в две форми – суха и с пара. Основните предимства на стерилизацията с топлина включват способността ѝ да унищожава всички биологични материали (включително приони), без да оставя замърсители или остатъци [14]. Друго предимство е ниската цена, особено по отношение на консумативите: най-много са необходими само електроенергия и вода. Рисковете, свързани с топлинната стерилизация, също са ниски, въпреки че съществува опасност от изгаряния при допир до горещи стерилизирани предмети. 

Термичната стерилизация засяга първо външните повърхности на стерилизирания обект, след което се разпространява навътре, докато целият материал бъде стерилизиран. Топлината денатурира протеините, съдържащи се в микроорганизмите и биологичния материал, а тъй като прионите са протеини, те също се повлияват от топлинната стерилизация. Процесът на денатуриране променя водородните и дисулфидните връзки, както и солевите мостове, и променя вторичната, третичната и четвъртичната структура на протеините, което ги прави нефункционални за биологични процеси [15].

Стерилизацията със суха топлина включва създаване на среда с температура от 160 °C до 170 °C и поддържането ѝ в продължение на два до четири часа. Тази комбинация от време и температура означава, че стерилизирането на термочувствителни материали като пластмасите чрез този метод е невъзможно без деградация на материала [16]. Остриетата традиционно се стерилизират със суха топлина, тъй като съществуват опасения, че парата може да ги затъпи. Проучвания обаче показват, че остриетата от неръждаема стомана, стерилизирани с пара, показват пренебрежимо затъпяване [17].

Стерилизацията с пара е по-бърз и по-малко термично интензивен процес в сравнение със стерилизацията със суха топлина. Парата пренася топлинната енергия по-ефективно от горещия въздух, което означава, че за стерилизация могат да се използват по-ниска температура (121 °C – 134 °C) и по-кратко време (от 3 до 15 минути). Точката на кипене на водата при атмосферно налягане е 100 °C, което е твърде ниска температура за стерилизацията. Поради това парата трябва да се генерира в среда под налягане, което повишава точката на кипене на водата до необходимата температура. 

Предмети, които могат да издържат на температура до 134 °C, могат да бъдат стерилизирани с пара, но трябва да са в състояние да издържат на комбинацията от температура, влага и налягане. За тези, които могат, стерилизацията с пара представлява изключително ефективна и дълбоко проникваща форма на стерилизация.

Обобщение

Окончателното решение за стерилизация не е еднозначно. Въпреки това е възможно да се ориентираме сред сложностите и да намерим подходящия вариант, като се фокусираме основно върху въпросните предмети и изискваното им състояние след стерилизацията.

Филтрацията е подходящ вариант за стерилизация на ограничен обем течности, особено чувствителни към топлина, радиация и химическа стерилизация. Важно е да се има предвид, че този метод изисква комбинация с други форми на стерилизация за деактивиране на микроорганизмите.

Обхващайки различни варианти с различна проникваща способност, радиацията е добър вариант, ако материалите са чувствителни към топлина и могат да издържат на нейните увреждащи ефекти. Въпреки това, тя е скъпа за внедряване и за да бъде рентабилна, зависи от мащаба на използването ѝ.

Химическата стерилизация, макар и свързана с токсичност, остатъци и логистични проблеми, както и с постоянни разходи за консумативи, има своята роля, когато обектът, подлежащ на стерилизация, е несъвместим с други техники за стерилизация – например твърд материал, чувствителен към топлина и радиация.

За обекти, които не са чувствителни към топлина, влага и — до известна степен — налягане, стерилизацията с пара често се очертава като най-добрият избор, предлагащ икономическа ефективност, ефикасност и бързина. Това важи и за отпадъчните материали, при които състоянието им след стерилизацията не представлява проблем. Поради това автоклавът остава незаменимо оборудване за почти всички лаборатории, докато системите за деконтаминация на отпадъчни течности с парно нагряване (EDS) предлагат отлична възможност за тези, които трябва да се освободят от биологично активни течни отпадъци. Свържете се с Astell Scientific на Info@Astell.com, ако се нуждаете от повече информация за стерилизацията с пара.  

Чрез анализ на материала, подлежащ на стерилизация, е възможно да се намери техника за стерилизация, която най-добре отговаря на идеалния модел. Комбинацията от скорост, ефективност, съвместимост с материала, нетоксичност, адаптивност и възможност за мониторинг може да бъде оценена за конкретната ситуация, наред с капацитета за преодоляване на евентуална устойчивост на целевия материал. Разбира се, рентабилността ще бъде ключов фактор в повечето организации.

Източници

1. Schneider, P. (1994). Алтернативи за нискотемпературна стерилизация през 90-те години. Tappi Journal; (САЩ), 77(1).

2. Rutala, William A. и David J. Weber. „Клинична ефективност на технологиите за нискотемпературна стерилизация.“ Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Кавикиоли, Рикардо; Островски, Мартин (юни 2003). Енциклопедия на биологичните науки. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Посетено на 26 септември 2017 г.

4. Дуда, В.; Сузина, Н.; Поливцева, В.; Боронин, А. (2012). „Ултрамикробактерии: формиране на концепцията и приносът на ултрамикробактериите към биологията“. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Янсен, Петер; Шуман, Александра; Мьоршел, Ерхард; Рейни, Фредерик (април 1997). „Нови анаеробни ултрамикробактерии, принадлежащи към бактериалния род Verrucomicrobiales, изолирани чрез култура на разреждане от безазотна почва на оризище“. Приложна и екологична микробиология. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Рискове при използването на стерилизация с гама-лъчи: другата страна на монетата. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Публикувано на 18 януари 2018 г. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell и Connor, J. (2011). Стерилизация на биоматериали от синтетичен и биологичен произход. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Насоки за дезинфекция и стерилизация на медицински инструменти, замърсени с приони. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Гомине, М., Вадро, С., Остри, Г., и Дарборд, Ж. С. (2007). Инактивиране на прионната инфекциозност чрез йонизиращи лъчи. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Симънс, А. (2012). Бъдещи тенденции в стерилизацията на биоматериали и медицински изделия. В „Стерилизация на биоматериали и медицински изделия“ (стр. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Министерство на труда на Съединените щати, 2020. Етиленов оксид. [онлайн] Администрация по безопасност и здраве при работа. Достъпно на: [Посетено на 25 септември 2020 г.].

12. Национален център за биотехнологична информация (2020). Обобщение на съединението в PubChem за CID 6354, Етиленов оксид. Извлечено на 23 септември 2020 г. от https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Плазма от водороден пероксид | Насоки за дезинфекция и стерилизация | Библиотека с насоки | Контрол на инфекциите. Извлечено на 27 септември 2020 г. от https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Стерилизация с пара и суха топлина на биоматериали и медицински изделия. В „Стерилизация на биоматериали и медицински изделия“ (стр. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Мауер, Л. (2003). ПРОТЕИНИ | Термична обработка на хранителни протеини.

16. Вини Р. Састри (2014). Изисквания към материалите за пластмаси, използвани в медицински изделия, в „Пластмаси в медицинските изделия“ (Второ издание).

17. Вендрел, Р. Дж., Хейдън, К. Л., и Талумис, Л. Дж. (2002). Ефект на стерилизацията с пара в сравнение със стерилизацията със суха топлина върху износването на ортодонтските клещи за рязане на лигатури. Американски вестник по ортодонтия и дентално-лицева ортопедия, 121(5), 467–471.

Публикувано за първи път в Labmate UK & Ireland, том 45, брой 7.