Opnåelse af aseptiske forhold – Valg af steriliseringsmetode.

Sterilisering af mikroorganismer og biologisk materiale er en forudsætning for både eksperimentel og miljømæssig kontrol i laboratorier inden for utallige discipliner. 

Uanset om det drejer sig om at sikre aseptiske forhold i en dyrkningsplade eller opretholde et område med biologisk indeslutning, er målet med sterilisering altid at udrydde uønskede biologiske agenser. Dette mål kan nås gennem en række forskellige procedurer, der hver har deres egne fordele og ulemper.

Den ideelle steriliseringsproces skal fungere hurtigt og effektivt og deaktivere mikroorganismer og uønsket biologisk materiale, såsom prioner. Den bør desuden sikre minimal toksicitet, minimale sundhedsrisici for operatørerne og minimale ændringer af de steriliserede genstande, samtidigt med at den giver maksimal tilpasningsevne – så den kan håndtere forskellige materialer. Proceduren bør også være i stand til at overvinde enhver fysisk modstand mod sterilisering, som de materialer, der skal steriliseres, udviser. Alt dette bør ideelt set opnås på en omkostningseffektiv måde, hvilket også muliggør konsekvent overvågning [1] [2]. 

Det er imidlertid ofte urealistisk at opfylde alle disse betingelser. Derfor er inddragelsen af mange af disse faktorer ofte et sekundært hensyn, der afhænger af situationen og nødvendigheden, idet det primære mål er at opnå aseptiske forhold i et funktionsdygtigt slutprodukt. I det følgende gives en vurdering af almindeligt tilgængelige steriliseringsmetoder samt deres fordele og ulemper.

Steril filtrering

Ved sterilisation af flydende materialer er filtrering en mulighed. En væske eller gas føres gennem en steriliserende filtermembran, der udgør en mekanisk barriere for alle partikler med en diameter, der er større end porerne i membranen. Mikroorganismer, der er større end porerne, tilbageholdes bag filteret, hvilket sikrer, at de ikke kan trænge ind i filtratet. 

Varme, stråling og kemiske steriliseringsmidler virker ved at ændre de fysiske strukturer i molekyler og organeller i mikroorganismer – en proces, der også kan ændre de strukturelle komponenter i mere følsomme stoffer. Filtrering har ingen sådanne virkninger, men fjerner kun partikler over en bestemt størrelse. Derfor er filtrering et fornuftigt valg til mere ustabile og reaktive væsker.

I modsætning til andre steriliseringsmetoder deaktiverer filtrering ikke mikrobiologiske enheder. Derfor er andre steriliseringsprocedurer – ofte varme eller stråling – nødvendige for at sterilisere filteret og restproduktet efter behandlingen.

Der skal også lægges stor vægt på porestørrelsen i filteret. Ofte anvendes en porestørrelse på 0,2 μm — og da den mindste mycoplasma måler omkring 0,3 μm — er dette tilstrækkeligt til at filtrere de fleste bakterier fra. Ultramikrobakterier kan dog måle mindre end 0,1 μm [3] [4] [5], mens vira og prioner ofte er endnu mindre. Ved at reducere porestørrelsen til 0,001 μm sikres det, at færre mikrobiologiske enheder kan trænge ind i filtratet, selvom dette i stigende grad begrænser de væsker, der kan filtreres. En reduktion af porestørrelsen øger også behandlingstiden – et filter med en porestørrelse på 0,1 μm vil have omkring 40 % af gennemstrømningshastigheden i forhold til et filter med en porestørrelse på 0,2 μm.

Stråling

Som steriliseringsmiddel findes stråling i flere former. Tag for eksempel ioniserende strålingssterilisatorer, herunder røntgenstråler, gammastråler og elektronstråler. Disse teknologier steriliserer ved elektromagnetisk at anspore partikler i det område, der skal steriliseres, hvilket får dem til at frigive frie radikaler. Disse radikaler binder sig til dobbeltbindingerne i biomolekyler (såsom DNA, RNA og enzymer), ændrer deres form, standser deres funktion og medfører, at de mikroorganismer, der indeholder dem, bliver inaktive. Ikke-ioniserende strålingssteriliseringsmidler virker ved at få nye bindinger – pyrimidindimere – til at danne sig mellem nukleobaser i DNA, hvilket – ligesom ved ioniserende stråling – ændrer makromolekylets struktur og standser dets funktion. 

På grund af deres virkemåde kan strålingssteriliseringsmidler nedbryde organiske kemikalier såsom plast [6] [7] og biologisk materiale. Desværre omfatter deres nedbrydende virkninger ikke prioner, som forbliver alt for stabile til at blive påvirket af strålingssteriliseringsmidler. [8] Det er dog værd at bemærke, at nogle undersøgelser viser en mulighed for prion-denaturering via gammastråling [9]. 

En yderligere væsentlig overvejelse er, at strålingssterilisatorers gennemtrængningsevne og behandlingstider varierer betydeligt.  Ultraviolet lys (UV) kan kun trænge igennem gennemsigtige materialer, hvilket gør det til et brugbart steriliseringsmiddel til luft og renset omvendt osmosevand, men det er begrænset til overfladesterilisering af uigennemsigtige stoffer. UV-strålingens behandlingstid kan også strække sig over flere timer, ligesom det er tilfældet med røntgenstråler og gammastråler. Disse to sidstnævnte metoder har dog deres egne fordele. 

Gamma- og røntgenstråler har stor gennemtrængningsevne, hvilket betyder, at de kan anvendes til at sterilisere genstande, der befinder sig i ellers uigennemtrængelige beholdere. Elektronstråle-steriliseringens største fordel er, at den steriliserer næsten øjeblikkeligt. Ofte anvendes den som et overfladesteriliseringsmiddel på grund af elektronpartiklernes ringe gennemtrængningsevne – men med tilstrækkelig energi kan den også trænge dybt ind i materialet.

Driftsomkostningerne for røntgenstråler, elektronstråler og UV kan være relativt lave, idet effektivt strømforbrug er et kendetegn ved dem alle. Udstyr til røntgenstråler, elektronstråler og gammastråler har høje startomkostninger [10]. Gammastrålingssterilisering indebærer løbende omkostninger i forbindelse med udskiftning af strålekilden, som typisk er kobolt-60-isotopen. Det skal dog bemærkes, at selvom operatører altid skal beskyttes mod de skadelige virkninger af alle strålingssteriliseringsmetoder, betyder den fysiske tilstedeværelse af radioaktivt materiale i gammastrålingssterilisatorer, at der skal træffes ekstra forholdsregler under vedligeholdelse af udstyret.    

Kemisk

Kemiske steriliseringsmidler omfatter en bred vifte af væsker og gasser med ét fælles træk – deres evne til at ødelægge mikrobielt liv. På grund af disse egenskaber er de ofte skadelige for mennesker, hvis ikke dødelige. Det mest anvendte kemiske steriliseringsmiddel – ethylenoxid – kan på kort sigt forårsage hovedpine, kvalme, opkast, diarré, åndenød, irritation af luftvejene, lungeskader og cyanose, mens langvarig eksponering er forbundet med forekomster af kræft, mutagene forandringer, neurotoksicitet og sensibilisering [11]. 

Ethylenoxidgas steriliserer ved alkylering af proteiner, DNA og RNA, hvilket gør mikroorganismerne ikke-levedygtige [7]. Denne proces sker som følge af forbindelsens høje reaktivitet – en egenskab, der medfører logistiske komplikationer. På grund af en kombination af dets toksicitet og brandfarlighed anbefales det, at ethylenoxid opbevares i et fritstående lagerrum – med en isolationszone på 100 m i radius etableret i tilfælde af en lækage [12]. 

Som de fleste kemiske steriliseringsmidler er ethylenoxid ineffektivt over for prioner og kan efterlade rester på de steriliserede overflader. Sterilisationstiden er desuden lang – mellem 2 og 5 timer – og behandlingstiden endnu længere; ofte over 14 timer på grund af fjernelse af damp efter steriliseringen. Alligevel har det en høj gennemtrængningsevne, virker ved lave temperaturer (mellem 29–65 °C) og reagerer ikke med de fleste plasttyper.  

Et yderligere interessant fremskridt på dette område er gasplasmasterilisering. Hydrogenperoxid-gasplasma dannes ved at stimulere hydrogenperoxid-damp ved hjælp af et elektrisk felt, hvilket får den til at udvikle frie radikaler, der denaturerer biologiske materialer, ligesom ved proceduren med ioniserende stråling. Hydrogenperoxid-gasplasma har vist sig effektivt mod prioner, virker ved lave temperaturer (37–44 °C) og har en cyklustid på under 75 minutter [13]. Processen har dog ringe gennemtrængningsevne, og det hydrogenperoxid, den er afhængig af, er et giftigt, eksplosivt stof.

Varme

Varmesterilisering er den ældste og enkleste form for sterilisering og findes i to former – tør og med damp. De vigtigste fordele ved varmesterilisering er dens evne til at ødelægge alt biologisk materiale (herunder prioner), uden at efterlade forurenende stoffer eller rester [14]. En anden fordel er de lave omkostninger, især hvad angår forbrugsmaterialer: Der kræves højst elektricitet og vand. Farerne ved varmesterilisering er også begrænsede, selvom der er risiko for forbrændinger ved berøring af varme, steriliserede genstande. 

Varmesterilisering påvirker først de ydre overflader af det objekt, der steriliseres, og breder sig derefter indad, indtil hele materialet er blevet steriliseret. Varme denaturerer de proteiner, der findes i mikroorganismer og biologisk materiale, og da prioner er proteiner, påvirkes de også af varmesterilisering. Denatureringsprocessen ændrer hydrogen- og disulfidbindinger samt saltbroer og forandrer proteinerne sekundære, tertiære og kvaternære struktur, hvilket gør dem ubrugelige til biologiske processer [15].

Sterilisering med tør varme indebærer, at der skabes et miljø med en temperatur på 160 °C til 170 °C, som opretholdes i mellem to og fire timer. Denne kombination af tid og temperatur betyder, at det ikke er muligt at sterilisere varmefølsomt materiale, såsom plast, ved hjælp af denne metode uden at materialet nedbrydes [16]. Knive er traditionelt blevet steriliseret med tør varme, da der er bekymring for, at damp kan gøre dem sløve. Undersøgelser har imidlertid vist, at knive af rustfrit stål, der er steriliseret med damp, kun udviser ubetydelig slibning [17].

Dampsterilisering er en hurtigere og mindre varmeintensiv proces end sterilisering med tør varme. Damp overfører varmeenergi mere effektivt end varm luft, hvilket betyder, at der kan anvendes en lavere temperatur (121 °C – 134 °C) og kortere tid (3 til 15 minutter) til sterilisering. Vandets kogepunkt ved atmosfærisk tryk er 100 °C, hvilket er for lavt til steriliseringsprocessen. Derfor genereres dampen i en trykbeholder, hvilket hæver vandets kogepunkt til den krævede temperatur. 

Genstande, der tåler en temperatur på 134 °C eller derunder, kan steriliseres med damp, men skal kunne modstå en kombination af temperatur, fugt og tryk. For genstande, der opfylder disse krav, udgør dampsterilisering en effektiv og gennemtrængende metode.

Resumé

Den endelige konklusion vedrørende sterilisering er ikke entydig. Men det er muligt at finde vej gennem kompleksiteten og vælge den rigtige løsning ved at holde fokus på de pågældende genstande og de krav, der stilles til deres tilstand efter steriliseringen.

Filtrering er en fremragende løsning til sterilisering af et begrænset antal væsker – især væsker, der er følsomme over for varme, stråling og kemisk sterilisering. Beslutninger skal dog træffes i bevidstheden om, at filtrering er afhængig af andre steriliseringsmetoder for at inaktivere mikroorganismer gennem sin mekanisme.

Stråling, der omfatter flere varianter med forskellige gennemtrængningsevner, er en god løsning, hvis materialerne er varmefølsomme og kan modstå strålingens skadelige virkninger. Det er dog dyrt at etablere og afhænger af anvendelsesomfanget for at være omkostningseffektivt.

Kemisk sterilisering indebærer toksicitet, reststoffer, logistiske udfordringer og løbende omkostninger til forbrugsmaterialer, men er en effektiv løsning, når genstanden ikke er kompatibel med andre metoder – f.eks. et fast materiale, der er følsomt over for varme og stråling.

For genstande, der ikke er følsomme over for varme, fugt og – i et vist omfang – tryk, vil dampsterilisering ofte fremstå som det oplagte valg, da den tilbyder omkostningseffektivitet, effektivitet og hurtighed. Dette gælder også for affaldsmaterialer, hvor tilstanden efter sterilisering ikke er af betydning. Derfor er en autoklave fortsat uundværligt udstyr for næsten alle laboratorier, mens dampopvarmede systemer til dekontaminering af spildevand (EDS) udgør en fremragende løsning for dem, der skal bortskaffe biologisk aktivt flydende affald. Kontakt Astell Scientific via Info@Astell.com, hvis du har brug for yderligere oplysninger om dampbaseret varmesterilisering.  

Gennem analyse af det materiale, der skal steriliseres, er det muligt at finde en steriliseringsteknik, der bedst passer til den ideelle model. En kombination af hastighed, effektivitet, materialekompatibilitet, ikke-toksicitet, tilpasningsevne og overvågningsmuligheder kan alle vurderes i forhold til den pågældende situation, sammen med evnen til at overvinde eventuel materialemodstand, der måtte forekomme i målmaterialet. Naturligvis vil omkostningseffektivitet være en nøglefaktor i de fleste organisationer.

Referencer

1. Schneider, P. (1994). Alternativer til lavtemperatursterilisering i 1990’erne. Tappi Journal;(USA), 77(1).

2. Rutala, William A., og David J. Weber. »Klinisk effektivitet af lavtemperatursteriliseringsteknologier.« Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (juni 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Hentet 26. september 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). »Ultramikrobakterier: Begrebets tilblivelse og ultramikrobakteriers bidrag til biologien«. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (april 1997). "Nye anaerobe ultramikrobakterier tilhørende den bakterielle slægt Verrucomicrobiales, isoleret ved fortyndingsdyrkning fra anoxisk rismarkjord". Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Risici ved anvendelse af sterilisering med gammastråling: Den anden side af medaljen. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Udgivet 18. januar 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell og Connor, J. (2011). Sterilisering af biomaterialer af syntetisk og biologisk oprindelse. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Retningslinjer for desinfektion og sterilisering af prionforurenede medicinske instrumenter. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inaktivering af prioners infektivitet ved hjælp af ioniserende stråling. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Fremtidige tendenser inden for sterilisering af biomaterialer og medicinsk udstyr. I Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Det amerikanske arbejdsministerium, 2020. Ethylenoxid. [online] Arbejdssikkerheds- og sundhedsadministrationen. Tilgængelig på: [Hentet 25. september 2020].

12. National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem-stofoversigt for CID 6354, ethylenoxid. Hentet den 23. september 2020 fra https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Hydrogenperoxidgasplasma | Retningslinjer for desinfektion og sterilisering | Retningslinjebibliotek | Infektionskontrol. Hentet den 27. september 2020 fra https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilisering af biomaterialer og medicinsk udstyr med damp og tør varme. I Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Varmebehandling af fødevareproteiner.

16. Vinny R. Sastri (2014). Materialekrav til plast anvendt i medicinsk udstyr, i Plastics in Medical Devices (2. udgave).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Effekten af sterilisering med damp sammenlignet med tørvarme på slitage af tandregulerings-ligaturskæretænger. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, 121(5), 467–471.

Først offentliggjort i Labmate UK & Ireland, bind 45, nr. 7.