Att uppnå aseptik – Val av steriliseringsmetod.

Sterilisering av mikroorganismer och biologiskt material är en förutsättning för både experimentell kontroll och miljökontroll i laboratorier inom en mängd olika discipliner. 

Oavsett om det handlar om att säkerställa aseptiska förhållanden i en odlingsplatta eller upprätthålla ett område med biologisk inneslutning, är målet med sterilisering alltid att utrota oönskade biologiska agens. Detta mål kan uppnås genom en rad olika procedurer, var och en med sina egna fördelar och nackdelar.

Den ideala steriliseringsprocessen måste fungera snabbt och effektivt och inaktivera mikroorganismer och oönskat biologiskt material, såsom prioner. Den bör också säkerställa minimal toxicitet, minimala hälsorisker för operatörer och minimala förändringar av de steriliserade föremålen, samtidigt som den erbjuder maximal anpassningsförmåga – så att den kan hantera olika material. Metoden bör även kunna övervinna eventuellt fysiskt motstånd mot sterilisering som uppvisas av de material som ska steriliseras. Allt detta bör helst uppnås på ett kostnadseffektivt sätt, vilket också möjliggör kontinuerlig övervakning [1] [2]. 

Att uppfylla samtliga dessa villkor är ofta praktiskt svårgenomfört. Därför blir många av dessa faktorer ofta en sekundär fråga som beror av situation och nödvändighet, där det primära målet är att uppnå aseptiska förhållanden i en funktionsduglig slutprodukt. Nedan följer en bedömning av vanligt förekommande steriliseringsmetoder, deras fördelar och nackdelar.

Steril filtrering

Om ett flytande material ska steriliseras är filtrering ett alternativ att överväga. En vätska eller gas kan ledas genom ett steriliserande filtermembran, vilket bildar en mekanisk barriär mot alla partiklar med en diameter större än porerna i membranet. Mikroorganismer som är större än porerna fastnar bakom filtret, vilket säkerställer att de inte kan tränga in i filtratet. 

Värme, strålning och kemiska steriliseringsmedel verkar genom att förändra de fysiska strukturerna hos molekyler och organeller inom mikroorganismer – en process som även kan förändra de strukturella komponenterna hos mer känsliga ämnen. Filtrering har inga sådana effekter, utan avlägsnar endast partiklar över en viss storlek. Därför utgör filtrering ett rimligt val för mer instabila och reaktiva vätskor.

Till skillnad från andra steriliseringsmetoder inaktiverar filtrering inte mikrobiologiska enheter. Därför krävs andra steriliseringsförfaranden – ofta värme eller strålning – för att sterilisera filtret och restmaterialet efter bearbetningen.

Man måste också ägna stor uppmärksamhet åt porstorleken i filtret. Ofta används en porstorlek på 0,2 μm – och eftersom den minsta mykoplasman mäter cirka 0,3 μm – räcker detta för att filtrera bort de flesta bakterier. Ultramikrobakterier kan dock vara mindre än 0,1 μm [3] [4] [5], medan virus och prioner ofta är ännu mindre. Genom att minska porstorleken till 0,001 μm säkerställs att färre mikrobiologiska enheter kan tränga in i filtratet, även om detta i allt högre grad begränsar vilka vätskor som kan filtreras. En minskning av porstorleken ökar också bearbetningstiden – ett filter med 0,1 μm porstorlek kommer att ha cirka 40 % av flödeshastigheten hos ett filter med 0,2 μm porstorlek.

Strålning

Som steriliseringsmedel förekommer strålning i flera former. Ta till exempel joniserande strålning, såsom röntgenstrålning, gammastrålning och elektronstrålar. Dessa tekniker steriliserar genom att elektromagnetiskt excitera partiklar i det område som ska steriliseras, vilket får dem att avge fria radikaler. Dessa radikaler binder till dubbelbindningarna i biomolekyler (såsom DNA, RNA och enzymer), vilket förändrar deras form, stoppar deras funktion och leder till att de mikroorganismer som innehåller dem blir inaktiva. Steriliseringsmedel som använder icke-joniserande strålning verkar genom att orsaka bildandet av nya bindningar – pyrimidindimerer – mellan nukleobaserna i DNA, vilket – precis som med joniserande strålning – förändrar makromolekylens struktur och hindrar den från att fungera. 

På grund av sin verkningsmekanism kan strålningssteriliseringsmedel bryta ned organiska kemikalier såsom plaster [6] [7] och biologiskt material. Tyvärr sträcker sig deras nedbrytande effekter inte till prioner, som i stort sett är alltför stabila för att påverkas av strålningssteriliseringsmedel. [8] Det är dock värt att notera att vissa studier visar på en möjlighet till priondenaturering via gammastrålning [9]. 

En ytterligare viktig aspekt är att strålningssteriliseringsmedlens genomträngningsförmåga och behandlingstider varierar avsevärt.  Ultraviolett ljus (UV) kan endast tränga igenom transparenta material, vilket gör det till ett lämpligt steriliseringsmedel för luft och renat omvänd osmosvatten, men det är begränsat till ytsterilisering av ogenomskinliga ämnen. Behandlingstiden för UV-strålning kan också ta flera timmar, precis som för röntgenstrålning och gammastrålning. Dessa två sistnämnda metoder har dock sina egna fördelar. 

Gamma- och röntgenstrålning har hög genomträngningsförmåga, vilket innebär att de kan användas för att sterilisera föremål som förvaras i annars ogenomträngliga behållare. Elektronstrålesteriliseringens främsta fördel är att den steriliserar nästan omedelbart. Ofta används den som ytsteriliseringsmetod på grund av elektronpartiklarnas dåliga genomträngningsförmåga – men med tillräcklig energi kan även den tränga djupt in i materialet.

Driftskostnaderna för röntgenstrålning, elektronstråle och UV-strålning kan vara relativt låga, och alla tre kännetecknas av en effektiv elanvändning. Utrustningen för röntgenstrålning, elektronstråle och gammastrålning medför höga initiala investeringskostnader [10]. Gammastrålningssterilisering medför löpande kostnader i samband med utbyte av strålkällan, vanligtvis isotopen kobolt-60. Man bör dock beakta att även om operatörer alltid ska skyddas mot de skadliga effekterna av alla strålningssteriliseringsmetoder, innebär den fysiska närvaron av radioaktivt material i gammastrålningssterilisatorer att extra försiktighetsåtgärder måste vidtas vid underhåll av utrustningen.    

Kemiska

Kemiska steriliseringsmedel omfattar ett brett spektrum av vätskor och gaser med ett gemensamt drag – deras förmåga att förstöra mikrobiellt liv. På grund av dessa egenskaper är de ofta skadliga för människor, om inte dödliga. Det vanligaste kemiska steriliseringsmedlet – etylenoxid – kan på kort sikt orsaka huvudvärk, illamående, kräkningar, diarré, andnöd, irritation i luftvägarna, lungskador och cyanos, medan långvarig exponering är förknippad med förekomst av cancer, mutagena förändringar, neurotoxicitet och sensibilisering [11]. 

Etylenoxidgas steriliserar genom alkylering av proteiner, DNA och RNA, vilket gör att mikroorganismerna blir livlösa [7]. Denna process beror på föreningens höga reaktivitet, en egenskap som medför logistiska komplikationer. På grund av en kombination av dess toxicitet och brandfarlighet rekommenderas att etylenoxid förvaras i en fristående förvaringsenhet – med en isoleringszon med en radie på 100 m inrättad för det fall att ett läckage skulle inträffa [12]. 

Liksom de flesta kemiska steriliseringsmedel är etylenoxid verkningslöst mot prioner och kan lämna rester på steriliserade ytor. Steriliseringstiden är dessutom lång – mellan 2 och 5 timmar – och behandlingstiden ännu längre; ofta över 14 timmar på grund av avdunstning efter steriliseringen. Den har dock hög penetrationsförmåga, fungerar vid låga temperaturer (29–65 °C) och reagerar inte med de flesta plaster.  

En ytterligare intressant utveckling inom detta område är gasplasmasterilisering. Väteperoxidgasplasma skapas genom att väteperoxidånga exciteras med hjälp av ett elektriskt fält, vilket får den att avge fria radikaler som denaturerar biologiskt material, precis som vid joniserande strålning. Väteperoxidgasplasma har visat sig vara effektivt mot prioner, fungerar vid låga temperaturer (37–44 °C) och har en cykeltid på mindre än 75 minuter [13]. Processen har dock dålig genomträngningsförmåga och den väteperoxid som den bygger på är ett giftigt, explosivt ämne.

Värme

Värmesterilisering är den äldsta och enklaste formen av sterilisering och förekommer i två former – torrsterilisering och ångsterilisering. De viktigaste fördelarna med värmesterilisering är dess förmåga att förstöra allt biologiskt material (inklusive prioner) utan att lämna kvar några föroreningar eller rester [14]. En annan fördel är den låga kostnaden, särskilt när det gäller förbrukningsmaterial: som mest krävs endast el och vatten. Riskerna i samband med värmesterilisering är också låga, även om det finns en risk för brännskador vid beröring av heta steriliserade föremål. 

Värmesteriliseringen påverkar först de yttre ytorna på det föremål som steriliseras och sprider sig sedan inåt tills hela materialet har steriliserats. Värmen denaturerar proteinerna i mikroorganismer och biologiskt material, och eftersom prioner är proteiner påverkas även de av värmesterilisering. Denatureringsprocessen förändrar väte- och disulfidbindningar samt saltbroar och förändrar proteinernas sekundära, tertiära och kvartära struktur, vilket gör dem obrukbara för biologiska processer [15].

Sterilisering med torr värme innebär att man skapar en miljö med en temperatur på 160–170 °C och upprätthåller den i mellan två och fyra timmar. Denna kombination av tid och temperatur innebär att det inte är möjligt att sterilisera värmekänsligt material, såsom plast, med denna metod utan att materialet bryts ned [16]. Blad har traditionellt steriliserats med torr värme, eftersom det finns farhågor för att ånga ska göra dem slöa. Studier har dock visat att blad av rostfritt stål som steriliserats med ånga uppvisar försumbar slöhet [17].

Ångsterilisering är en snabbare och mindre värmekrävande process än sterilisering med torr värme. Ånga överför värmeenergi mer effektivt än varmluft, vilket innebär att en lägre temperatur (121 °C – 134 °C) och kortare tid (3 till 15 minuter) kan användas för steriliseringen. Vattnets kokpunkt vid atmosfärstryck är 100 °C, vilket är för låg temperatur för steriliseringsprocessen. Därför måste ångan alstras i en trycksatt miljö, vilket höjer vattnets kokpunkt till den erforderliga temperaturen. 

Föremål som tål en värme på 134 °C eller lägre kan steriliseras med ånga, men måste kunna motstå en kombination av temperatur, fukt och tryck. För de som klarar detta är ångsterilisering en mycket effektiv och genomträngande steriliseringsmetod.

Sammanfattning

Den slutgiltiga slutsatsen när det gäller sterilisering är inte entydig. Men det är möjligt att navigera genom komplexiteten och hitta rätt alternativ genom att ha ett tydligt fokus på de aktuella föremålen och de krav som ställs på deras skick efter steriliseringen.

Filtrering är ett utmärkt alternativ för dem som steriliserar ett begränsat antal vätskor – särskilt sådana som är känsliga för värme, strålning och kemisk sterilisering. Men beslut måste fattas med vetskapen om att metoden är beroende av andra steriliseringsmetoder för att inaktivera mikroorganismer genom sin mekanism.

Strålning, som omfattar flera varianter med olika genomträngningsförmåga, är ett bra alternativ om materialen är värmekänsliga och tål dess skadliga effekter. Det är dock dyrt att installera och kräver en viss användningsskala för att vara kostnadseffektivt.

Kemisk sterilisering, även om den är förenad med toxicitet, restämnen och logistiska problem samt löpande kostnader för förbrukningsmaterial, har sin roll att spela när det objekt som ska steriliseras är oförenligt med andra steriliseringstekniker – till exempel ett fast material som är känsligt för värme och strålning.

För föremål som inte är känsliga för värme, fukt och – i viss utsträckning – tryck är ångsterilisering ofta det självklara valet, eftersom den erbjuder kostnadseffektivitet, effektivitet och snabbhet. Detta gäller även för avfallsmaterial där tillståndet efter steriliseringen inte är av betydelse. Därför förblir en autoklav en oumbärlig del av utrustningen för nästan alla laboratorier, medan ånguppvärmda system för dekontaminering av avloppsvatten (EDS) utgör ett utmärkt alternativ för dem som har biologiskt aktivt flytande avfall att hantera. Kontakta Astell Scientific via Info@Astell.com om du behöver mer information om ångbaserad värmesterilisering.  

Genom att analysera det material som ska steriliseras är det möjligt att hitta den steriliseringsteknik som bäst passar den ideala modellen. En kombination av hastighet, effektivitet, materialkompatibilitet, giftfrihet, anpassningsförmåga och möjlighet till övervakning kan alla utvärderas för den aktuella situationen, tillsammans med förmågan att övervinna eventuella motstånd som kan förekomma i målmaterialet. Naturligtvis kommer kostnadseffektivitet att vara en nyckelfaktor för de flesta organisationer.

Referenser

1. Schneider, P. (1994). Alternativ för lågtemperatursterilisering på 1990-talet. Tappi Journal; (USA), 77(1).

2. Rutala, William A., och David J. Weber. ”Klinisk effektivitet hos tekniker för lågtemperatursterilisering.” Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (juni 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Hämtad 26 september 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). ”Ultramikrobakterier: Begreppets tillkomst och ultramikrobakteriernas bidrag till biologin”. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (april 1997). ”Ny anaerob ultramikrobakterier tillhörande den bakteriella släktlinjen Verrucomicrobiales, isolerade genom utspädningsodling från syrefri risfältjord”. Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Risker med sterilisering genom gammastrålning: Den andra sidan av myntet. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Publicerad 18 januari 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q & Sun, Wendell & Connor, J. (2011). Sterilisering av biomaterial av syntetiskt och biologiskt ursprung. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Riktlinjer för desinfektion och sterilisering av prionkontaminerade medicinska instrument. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inaktivering av prioninfektivitet genom joniserande strålning. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760–1762.

10. Simmons, A. (2012). Framtida trender för sterilisering av biomaterial och medicintekniska produkter. I Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 310–320). Woodhead Publishing.

11. USA:s arbetsmarknadsdepartement, 2020. Etylenoxid. [online] Arbetsmiljömyndigheten (Occupational Safety and Health Administration). Tillgänglig på: [Hämtad 25 september 2020].

12. National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem-sammanfattning av ämne CID 6354, etylenoxid. Hämtat den 23 september 2020 från https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Väteperoxidgasplasma | Riktlinjer för desinfektion och sterilisering | Riktlinjebibliotek | Infektionskontroll. Hämtat den 27 september 2020 från https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Ång- och torrvärmesterilisering av biomaterial och medicintekniska produkter. I Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Värmebehandling av livsmedelsproteiner.

16. Vinny R. Sastri (2014). Materialkrav för plaster som används i medicintekniska produkter, i Plastics in Medical Devices (andra upplagan).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Effekten av sterilisering med ånga jämfört med torrvärme på slitaget på tångar för att klippa ortodontiska ligaturer. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467–471.

Först publicerad i Labmate UK & Ireland, volym 45, nummer 7.