Dosažení aseptických podmínek – výběr sterilizačního postupu.

Sterilizace mikroorganismů a biologického materiálu je nezbytným předpokladem pro experimentální i environmentální kontrolu v laboratořích napříč nesčetnými obory. 

Ať už jde o zajištění aseptických podmínek v kultivační misce nebo o udržení oblasti s biologickou izolací, cílem sterilizace je vždy odstranění nežádoucích biologických činitelů. Tohoto cíle lze dosáhnout různými postupy, z nichž každý má své výhody i nevýhody.

Ideální sterilizační proces musí být rychlý a efektivní; musí deaktivovat mikroorganismy a nežádoucí biologický materiál, jako jsou priony. Měl by také zajistit minimální toxicitu, minimální zdravotní rizika pro obsluhu a minimální změny na sterilizovaných předmětech, přičemž by měl poskytovat maximální přizpůsobivost – být vhodný pro různé materiály. Postup by měl být rovněž schopen překonat jakýkoli fyzikální odpor vůči sterilizaci, který vykazují sterilizované materiály. To vše by mělo být v ideálním případě dosaženo nákladově efektivním způsobem, který zároveň umožňuje důsledné monitorování [1] [2]. 

Splnění všech těchto požadavků je však často nepraktické. Z tohoto důvodu se zohlednění mnoha z těchto faktorů často stává druhořadým zájmem v závislosti na situaci a nutnosti, přičemž primárním cílem je dosažení aseptického stavu u funkčního konečného produktu. Následuje hodnocení běžně dostupných sterilizačních metod, jejich kladů a záporů.

Sterilní filtrace

Pokud má být sterilizována tekutina, lze zvážit možnost filtrace. Kapalinu nebo plyn lze nechat projít sterilizační filtrační membránou, která tvoří mechanickou bariéru pro všechny částice s průměrem větším než póry v membráně. Mikroorganismy větší než póry jsou zachyceny za filtrem, čímž je zajištěno, že se nemohou dostat do filtrátu. 

Teplo, záření a chemické sterilizační činidla působí tak, že mění fyzikální struktury molekul a organel uvnitř mikroorganismů – tento proces však může změnit i strukturální složky citlivějších látek. Filtrace žádné takové účinky nemá, pouze odstraňuje částice nad určitou velikost. Filtrace tak představuje vhodnou volbu pro nestabilnější a reaktivnější tekutiny.

Na rozdíl od jiných metod sterilizace však filtrace mikroorganismy nedeaktivuje, proto je nutné provést dodatečnou sterilizaci filtru a zbytků po zpracování, obvykle teplem nebo zářením.

Velkou pozornost je také třeba věnovat velikosti pórů ve filtru. Často se používá velikost pórů 0,2 μm – a vzhledem k tomu, že nejmenší mykoplazma měří přibližně 0,3 μm – je to dostatečné k odfiltrování většiny bakterií. Ultramikrobakterie však mohou měřit méně než 0,1 μm [3] [4] [5], zatímco viry a priony jsou často ještě menší. Snížení velikosti pórů na 0,001 μm zajišťuje, že do filtrátu pronikne méně mikrobiologických entit, i když se tím stále více omezuje množství tekutin, které lze filtrovat. Snížení velikosti pórů také prodlužuje dobu zpracování – filtr s póry o velikosti 0,1 μm bude mít přibližně 40 % průtoku ve srovnání s filtrem s póry o velikosti 0,2 μm.

Záření

Jako sterilizační prostředek má záření mnoho podob. Vezměme si například ionizující záření, včetně rentgenových paprsků, gama záření a elektronových svazků. Tyto technologie sterilizují elektromagnetickým buzením částic v sterilizované oblasti, což vede k uvolňování volných radikálů. Tyto radikály se spojují s dvojnými vazbami v biomolekulách (jako jsou DNA, RNA a enzymy), mění jejich strukturu, zastavují jejich funkci a vedou k zneškodnění mikroorganismů, které je obsahují. Sterilizační prostředky využívající neionizující záření působí tak, že způsobují tvorbu nových vazeb – pyrimidinových dimerů – mezi nukleovými bázemi v DNA, což – stejně jako u ionizujícího záření – mění strukturu makromolekuly a znemožňuje její fungování. 

Díky svému působení mohou radiační sterilizátory rozkládat organické látky, jako jsou plasty [6] [7] a biologický materiál. Bohužel se jejich degradační účinky nevztahují na priony, které zůstávají z velké části příliš stabilní na to, aby na ně radiační sterilizátory působily. [8] Je však třeba poznamenat, že některé studie ukazují možnost denaturace prionů pomocí gama záření [9]. 

Dalším významným hlediskem je, že penetrační schopnost a expoziční časy radiačních sterilizačních metod se značně liší.  Ultrafialové záření (UV) proniká pouze průhlednými materiály, takže je vhodné k sterilizaci vzduchu a čištěné vody z reverzní osmózy, u neprůhledných látek však působí pouze na povrchu. Doba zpracování UV zářením může trvat i několik hodin, stejně jako u rentgenového a gama záření. Tyto dvě poslední metody však nabízejí specifické výhody. 

Gama záření a rentgenové záření mají vysokou penetrační schopnost, což znamená, že je lze použít ke sterilizaci předmětů umístěných v jinak nepropustných nádobách. Hlavní předností sterilizace elektronovým paprskem je téměř okamžitá sterilizace. Často se používá jako povrchový sterilizační prostředek kvůli nízké penetrační schopnosti elektronových částic – při dostatečné energii však i tento paprsek dokáže hloubkově proniknout do hmoty.

Provozní náklady na rentgenové záření, elektronový paprsek a UV záření mohou být relativně nízké, přičemž efektivní využití elektřiny je charakteristickým rysem všech těchto metod. Zařízení pro rentgenové záření, elektronový paprsek a gama záření mají vysoké počáteční investiční náklady [10]. Gammasterilizace s sebou nese průběžné náklady spojené s výměnou zdroje záření, jímž je obvykle izotop kobaltu-60. Je však třeba si uvědomit, že zatímco obsluha by měla být vždy chráněna před škodlivými účinky všech sterilizačních záření, fyzická přítomnost radioaktivního materiálu v gammasterilizátorech znamená, že při údržbě zařízení je třeba dodržovat zvláštní bezpečnostní opatření.    

Chemické

Chemické sterilizační prostředky zahrnují širokou škálu kapalin a plynů, které spojuje jedna společná vlastnost – schopnost ničit mikrobiální život. Vzhledem k těmto vlastnostem jsou často pro člověka škodlivé, ne-li smrtelné. Nejčastěji používaný chemický sterilizační prostředek – ethylenoxid – může v krátkodobém horizontu způsobit bolesti hlavy, nevolnost, zvracení, průjem, dušnost, podráždění dýchacích cest, poškození plic a cyanózu, zatímco dlouhodobá expozice je spojována s výskytem rakoviny, mutagenními změnami, neurotoxicitou a senzibilizací [11]. 

Plynný ethylenoxid sterilizuje prostřednictvím alkylace bílkovin, DNA a RNA, což vede k životaschopnosti mikroorganismů [7]. K tomuto procesu dochází v důsledku vysoké reaktivity této sloučeniny; tato vlastnost vede k logistickým komplikacím. Vzhledem ke kombinaci jeho toxicity a hořlavosti se doporučuje skladovat ethylenoxid v samostatné skladovací jednotce – s izolační zónou o poloměru 100 m pro případ úniku [12]. 

Stejně jako většina chemických sterilizačních prostředků je ethylenoxid neúčinný proti prionům a může zanechávat zbytky na sterilizovaných površích. Doba sterilizace je rovněž dlouhá – mezi 2 a 5 hodinami – a doba zpracování ještě delší; často přesahuje 14 hodin kvůli odstraňování par po sterilizaci. Přesto má vysokou penetrační schopnost, působí při nízkých teplotách (mezi 29–65 °C) a nereaguje s většinou plastů.  

Dalším pokrokem v oblasti je sterilizace plynovou plazmou. Plazma z plynného peroxidu vodíku vzniká excitací par peroxidu vodíku v elektrickém poli, což vede k uvolnění volných radikálů denaturujících biologické materiály, obdobně jako u ionizujícího záření. Ukázalo se, že plynná plazma z peroxidu vodíku je účinná proti prionům, funguje při nízkých teplotách (37–44 °C) a má dobu cyklu kratší než 75 minut [13]. Tento proces má však nízkou penetrační schopnost a peroxid vodíku, na kterém je založen, je toxická a výbušná látka.

Teplo

Tepelná sterilizace je nejstarším a nejjednodušším druhem sterilizace a má dvě formy – suchou a parní. Mezi hlavní výhody tepelné sterilizace patří její schopnost zničit veškerý biologický materiál (včetně prionů), aniž by zanechávala kontaminanty nebo zbytky [14]. Další výhodou jsou nízké provozní náklady, protože jsou zapotřebí pouze elektřina a voda. Rizika spojená s tepelnou sterilizací jsou nízká, i když existuje riziko popálení při dotyku horkých sterilizovaných předmětů. 

Tepelná sterilizace nejprve působí na vnější povrchy sterilizovaného předmětu a poté se šíří dovnitř, dokud není sterilizován celý materiál. Teplo denaturuje bílkoviny nacházející se v mikroorganismech a biologickém materiálu, a protože priony jsou bílkoviny, působí na ně tepelná sterilizace také. Denaturační proces mění vodíkové a disulfidové vazby i solné můstky a mění sekundární, terciární a kvartérní strukturu bílkovin, čímž je činí nefunkčními pro biologické procesy [15].

Sterilizace suchým teplem spočívá ve vytvoření prostředí o teplotě 160 °C až 170 °C a jeho udržování po dobu dvou až čtyř hodin. Tato kombinace času a teploty znamená, že sterilizace materiálů citlivých na teplo, jako jsou plasty, touto metodou není proveditelná bez degradace materiálu [16]. Čepele se tradičně sterilizují suchým teplem, protože existují obavy, že by je pára otupila. Studie však prokázaly, že nerezové čepele sterilizované párou vykazují zanedbatelné otupení [17].

Sterilizace párou je rychlejší a méně energeticky náročná než sterilizace suchým teplem. Pára přenáší tepelnou energii efektivněji než horký vzduch, což umožňuje sterilizaci při nižší teplotě (121 °C – 134 °C) a po kratší dobu (3 až 15 minut). Bod varu vody při atmosférickém tlaku je 100 °C, což je pro sterilizační proces příliš nízká teplota. Proto musí být pára vytvářena v tlakovém prostředí, které zvyšuje bod varu vody na požadovanou teplotu. 

Předměty, které snášejí teplotu 134 °C nebo nižší, lze sterilizovat párou, musí však být schopny odolat kombinaci teploty, vlhkosti a tlaku. U těch, které to zvládnou, představuje parní sterilizace vysoce účinnou a důkladnou formu sterilizace.

Shrnutí

Konečné rozhodnutí o metodě sterilizace závisí na charakteru konkrétních předmětů a požadovaném výsledném stavu.

Filtrace je vhodná pro sterilizaci omezeného množství tekutin, zejména citlivých na teplo, záření a chemickou sterilizaci. Je však nutné mít na paměti, že tento postup vyžaduje kombinaci s jinými metodami pro spolehlivou deaktivaci mikroorganismů.

Záření, které zahrnuje několik variant s různou penetrační schopností, je vhodnou volbou pro materiály citlivé na teplo, pokud dokážou odolat jeho škodlivým účinkům. Jeho zavedení je však nákladné a jeho nákladová efektivita závisí na rozsahu použití.

Chemická sterilizace, ačkoli s sebou nese rizika toxicity, zbytků a logistických problémů spolu s průběžnými náklady na spotřební materiál, má své opodstatnění v případech, kdy je sterilizovaný předmět neslučitelný s jinými sterilizačními technikami – například u pevných materiálů citlivých na teplo a záření.

U předmětů, které nejsou citlivé na teplo, vlhkost a – do určité míry – tlak, se jako vynikající volba často jeví parní sterilizace; nabízí nákladovou efektivitu, účinnost a rychlost. To platí i pro odpadní materiály, u nichž není stav po sterilizaci předmětem zájmu. Autokláv tak zůstává nezbytným zařízením pro téměř všechny laboratoře, zatímco systémy dekontaminace odpadních vod s parním ohřevem (EDS) představují vynikající volbu pro ty, kteří potřebují likvidovat biologicky aktivní kapalný odpad. Pokud potřebujete více informací o tepelném sterilizování parou, kontaktujte společnost Astell Scientific na adrese Info@Astell.com.  

Analýzou sterilizovaného materiálu je možné najít sterilizační techniku, která nejlépe odpovídá ideálnímu modelu. Pro danou situaci lze posoudit kombinaci rychlosti, účinnosti, materiálové kompatibility, netoxičnosti, přizpůsobivosti a možnosti monitorování, a to spolu se schopností překonat případnou odolnost cílového materiálu. Klíčovým faktorem bude samozřejmě ve většině organizací nákladová efektivita.

Literatura

1. Schneider, P. (1994). Alternativy nízkoteplotní sterilizace v 90. letech. Tappi Journal; (Spojené státy), 77(1).

2. Rutala, William A. a David J. Weber. „Klinická účinnost technologií nízkoteplotní sterilizace.“ Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (červen 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Citováno 26. září 2017.

4. Duda, V.; Suzina, N.; Polivtseva, V.; Boronin, A. (2012). „Ultramikrobakterie: Vznik pojmu a přínos ultramikrobakterií pro biologii“. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (duben 1997). „Nové anaerobní ultramikrobakterie patřící do linie Verrucomicrobiales, izolované metodou ředění kultury z anoxické půdy rýžových polí“. Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Rizika použití sterilizace gama zářením: druhá strana mince. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Publikováno 18. ledna 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell a Connor, J. (2011). Sterilizace biomateriálů syntetického a biologického původu. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Pokyny pro dezinfekci a sterilizaci lékařských nástrojů kontaminovaných priony. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inaktivace infekčnosti prionů ionizujícím zářením. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760–1762.

10. Simmons, A. (2012). Budoucí trendy ve sterilizaci biomateriálů a zdravotnických prostředků. In Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (s. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Ministerstvo práce Spojených států amerických, 2020. Ethylenoxid. [online] Správa bezpečnosti a ochrany zdraví při práci. Dostupné na: [Citováno 25. září 2020].

12. Národní centrum pro biotechnologické informace (2020). Souhrn o sloučenině PubChem pro CID 6354, ethylenoxid. Citováno 23. září 2020 z https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Plazma z plynného peroxidu vodíku | Pokyny pro dezinfekci a sterilizaci | Knihovna pokynů | Kontrola infekcí. Citováno 27. září 2020 z https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilizace biomateriálů a zdravotnických prostředků párou a suchým teplem. In Sterilizace biomateriálů a zdravotnických prostředků (s. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Tepelné zpracování potravinových bílkovin.

16. Vinny R. Sastri (2014). Požadavky na materiály pro plasty používané v zdravotnických prostředcích, v publikaci Plastics in Medical Devices (druhé vydání).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Vliv sterilizace párou oproti sterilizaci suchým teplem na opotřebení ortodontických kleští na stříhání ligatur. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467–471.

Poprvé publikováno v časopise Labmate UK & Ireland, ročník 45, číslo 7.