Raggiungere l’asepsi: la scelta di una procedura di sterilizzazione.

La sterilizzazione della vita microbica e del materiale biologico costituisce un prerequisito fondamentale sia per il controllo sperimentale che per quello ambientale nei laboratori di innumerevoli discipline. 

Che si tratti di garantire condizioni asettiche in una piastra di coltura o di mantenere un’area di biocontenimento, l’obiettivo della sterilizzazione è sempre l’eradicazione degli agenti biologici indesiderati. Tale obiettivo può essere raggiunto attraverso una varietà di procedure, ciascuna con i propri vantaggi e svantaggi.

Il processo di sterilizzazione ideale deve agire in modo rapido ed efficace, inattivando i microrganismi e il materiale biologico indesiderato, come i prioni. Dovrebbe inoltre garantire una tossicità minima, rischi sanitari ridotti per gli operatori e alterazioni minime agli oggetti sterilizzati, fornendo al contempo la massima adattabilità — per adattarsi a materiali diversi. La procedura dovrebbe inoltre essere in grado di superare qualsiasi resistenza fisica alla sterilizzazione dimostrata dai materiali da sterilizzare. Tutto ciò dovrebbe idealmente essere realizzato in modo economicamente efficiente, consentendo al contempo un monitoraggio costante [1] [2]. 

Soddisfare contemporaneamente tutti questi requisiti risulta spesso impraticabile; di conseguenza, l’integrazione di molti di questi fattori diventa una preoccupazione secondaria, a seconda della situazione e delle necessità, mentre l’obiettivo primario rimane il raggiungimento dell’asepsi in un prodotto finale funzionale. Di seguito viene presentata una valutazione dei metodi di sterilizzazione comunemente disponibili, con i relativi aspetti positivi e negativi.

Filtrazione sterile

Se si deve sterilizzare un materiale fluido, la filtrazione rappresenta un’opzione da prendere in considerazione. Un liquido o un gas può essere fatto passare attraverso una membrana filtrante sterilizzante, che costituisce una barriera meccanica per tutte le particelle di diametro superiore a quello dei pori della membrana. I microrganismi più grandi dei pori rimangono intrappolati dietro il filtro, garantendo che non possano entrare nel filtrato. 

Il calore, le radiazioni e gli agenti chimici agiscono modificando le strutture fisiche delle molecole e degli organelli all’interno dei microrganismi – un processo che può alterare anche i componenti strutturali di sostanze più sensibili. La filtrazione non produce tali effetti, ma si limita a rimuovere le particelle di dimensioni superiori a una certa soglia. Pertanto, la filtrazione rappresenta una scelta plausibile per i fluidi più instabili e reattivi.

A differenza di altri metodi di sterilizzazione, la filtrazione non inattiva gli organismi microbiologici. Di conseguenza, sono necessarie altre procedure di sterilizzazione – spesso mediante calore o radiazioni – per sterilizzare il filtro e i residui dopo il trattamento.

Occorre inoltre prestare particolare attenzione alla dimensione dei pori del filtro. Spesso viene utilizzata una dimensione dei pori di 0,2 μm — e, dato che il micoplasma più piccolo misura circa 0,3 μm — ciò è sufficiente per filtrare la maggior parte dei batteri. Tuttavia, gli ultramicobatteri possono misurare meno di 0,1 μm [3] [4] [5], mentre i virus e i prioni sono spesso ancora più piccoli. Ridurre la dimensione dei pori a 0,001 μm garantisce che un numero minore di entità microbiologiche possa penetrare nel filtrato, sebbene ciò diventi sempre più limitante per i fluidi che possono essere filtrati. Una diminuzione della dimensione dei pori comporta inoltre un aumento dei tempi di trattamento: un filtro con pori da 0,1 μm avrà una portata pari a circa il 40% di quella di un filtro con pori da 0,2 μm.

Radiazioni

In quanto agente sterilizzante, la radiazione assume molteplici forme. Si considerino, ad esempio, gli agenti sterilizzanti a radiazione ionizzante, tra cui i raggi X, i raggi gamma e i fasci di elettroni. Queste tecnologie sterilizzano eccitando elettromagneticamente le particelle nell’area da sterilizzare, inducendole a rilasciare radicali liberi. Questi radicali si legano ai doppi legami presenti nelle biomolecole (quali DNA, RNA ed enzimi), modificandone la struttura, bloccandone la funzione e rendendo inattivi i microrganismi che li contengono. Gli agenti sterilizzanti a radiazioni non ionizzanti agiscono provocando la formazione di nuovi legami – i dimeri di pirimidina – tra le basi nucleiche del DNA, il che – analogamente alle radiazioni ionizzanti – altera la struttura della macromolecola e ne blocca il funzionamento. 

Grazie alla loro funzionalità, gli agenti sterilizzanti a radiazioni sono in grado di degradare sostanze chimiche organiche quali le materie plastiche [6] [7] e il materiale biologico. Purtroppo, i loro effetti degradativi non si estendono ai prioni, che rimangono in gran parte troppo stabili per essere influenzati da tali agenti. [8] Tuttavia, vale la pena notare che alcuni studi indicano la possibilità di una denaturazione dei prioni tramite radiazioni gamma [9]. 

Un’ulteriore considerazione importante è che la capacità di penetrazione e i tempi di trattamento degli agenti sterilizzanti a radiazioni variano in modo significativo.  La luce ultravioletta (UV) penetra solo nei materiali trasparenti, rendendola adatta per la sterilizzazione di aria e acqua purificata per osmosi inversa, ma ne limita l’azione a un trattamento superficiale sui materiali opachi. Anche i tempi di esposizione ai raggi UV possono protrarsi per ore, come avviene per i raggi X e i raggi gamma. Tuttavia, questi ultimi due metodi presentano vantaggi specifici. 

I raggi gamma e i raggi X sono altamente penetranti, il che significa che possono essere utilizzati per sterilizzare oggetti contenuti in recipienti altrimenti impermeabili. Il punto di forza della sterilizzazione a fascio di elettroni è la capacità di sterilizzare in modo quasi istantaneo. Spesso viene utilizzata come metodo di sterilizzazione superficiale a causa della scarsa capacità di penetrazione delle particelle di elettroni; tuttavia, se dotata di energia sufficiente, anche questa tecnica può penetrare in profondità nella materia.

I costi di esercizio per i raggi X, il fascio di elettroni e i raggi UV possono essere relativamente bassi, grazie all’uso efficiente dell’energia elettrica che caratterizza ciascuno di essi. Le apparecchiature a raggi X, a fascio di elettroni e a raggi gamma presentano un elevato costo iniziale di investimento [10]. La sterilizzazione con raggi gamma comporta un costo ricorrente legato alla sostituzione della sorgente di radiazione, comunemente l’isotopo cobalto-60. È tuttavia opportuno riconoscere che, sebbene gli operatori debbano sempre essere protetti dagli effetti dannosi di tutti gli agenti sterilizzanti a radiazione, la presenza fisica di materiale radioattivo negli sterilizzatori a raggi gamma implica la necessità di adottare precauzioni aggiuntive durante la manutenzione del dispositivo.    

Chimica

Gli agenti sterilizzanti chimici comprendono un’ampia gamma di liquidi e gas accomunati da una caratteristica fondamentale: la loro capacità di distruggere la vita microbica. A causa di tali caratteristiche, essi risultano spesso nocivi per l’uomo, se non addirittura letali. Lo sterilizzante chimico più comunemente utilizzato – l’ossido di etilene – può causare a breve termine mal di testa, nausea, vomito, diarrea, respiro affannoso, irritazione respiratoria, lesioni polmonari e cianosi, mentre l’esposizione a lungo termine è associata all’insorgenza di tumori, alterazioni mutagene, neurotossicità e sensibilizzazione [11]. 

L’ossido di etilene sterilizza per alchilazione di proteine, DNA e RNA, rendendo i microrganismi non vitali [7]. Questo processo deriva dall’elevata reattività del composto, che comporta complesse esigenze logistiche. A causa della combinazione di tossicità e infiammabilità, si raccomanda di conservare l’ossido di etilene in un locale di stoccaggio separato, con una zona di isolamento di 100 m predisposta in caso di perdita [12]. 

Come la maggior parte degli agenti sterilizzanti chimici, l’ossido di etilene è inefficace sui prioni e può lasciare residui sulle superfici sterilizzate. Anche il tempo di sterilizzazione è lungo – compreso tra 2 e 5 ore – e il tempo di trattamento lo è ancora di più; spesso supera le 14 ore a causa della rimozione del vapore post-sterilizzazione. Tuttavia, è altamente penetrante, agisce a basse temperature (tra 29 e 65 °C) e non reagisce con la maggior parte delle materie plastiche.  

Un ulteriore progresso in questo settore è rappresentato dalla sterilizzazione al plasma gassoso. Il plasma gassoso di perossido di idrogeno viene generato eccitando il vapore di perossido di idrogeno mediante un campo elettrico, provocandone la formazione di radicali liberi che denaturano i materiali biologici, analogamente alla procedura con radiazioni ionizzanti. Il plasma gassoso di perossido di idrogeno si è dimostrato efficace contro i prioni, opera a basse temperature (37–44 °C) e presenta una durata del ciclo inferiore a 75 minuti [13]. Tuttavia, il processo presenta scarse capacità di penetrazione e il perossido di idrogeno su cui si basa è una sostanza tossica ed esplosiva.

Calore

La sterilizzazione termica è il metodo più antico e semplice di sterilizzazione e si presenta in due forme: a secco e a vapore. Tra i principali vantaggi della sterilizzazione termica vi è la sua capacità di distruggere tutto il materiale biologico (compresi i prioni), senza lasciare contaminanti o residui [14]. Un ulteriore vantaggio è il basso costo operativo, soprattutto per i materiali di consumo: sono necessari solo elettricità e acqua. Anche i rischi associati alla sterilizzazione termica sono limitati, sebbene permanga il pericolo di ustioni dovuto al contatto con oggetti ancora caldi al termine del ciclo. 

La sterilizzazione a calore agisce innanzitutto sulle superfici esterne dell’oggetto da sterilizzare, per poi diffondersi verso l’interno fino a sterilizzare l’intero materiale. Il calore denatura le proteine presenti nei microrganismi e nel materiale biologico e, poiché i prioni sono proteine, anche essi sono interessati dalla sterilizzazione termica. Il processo di denaturazione altera i legami idrogeno e disolfuro, nonché i ponti salini, e modifica la struttura secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine, rendendole inattive per i processi biologici [15].

La sterilizzazione a calore secco prevede la creazione di un ambiente con temperatura compresa tra 160 °C e 170 °C e il suo mantenimento per un periodo compreso tra due e quattro ore. Questa combinazione di tempo e temperatura rende impraticabile la sterilizzazione di materiali sensibili al calore, quali le materie plastiche, mediante questo metodo senza che si verifichi un degrado del materiale [16]. Le lame sono state tradizionalmente sterilizzate con calore secco, poiché sussistono timori che il vapore ne provochi l’ottundimento. Tuttavia, alcuni studi hanno dimostrato che le lame in acciaio inossidabile sterilizzate con il vapore presentano un’opacizzazione trascurabile [17].

La sterilizzazione a vapore è un processo più rapido e meno intensivo in termini di calore rispetto alla sterilizzazione a calore secco. Il vapore trasferisce l’energia termica in modo più efficace rispetto all’aria calda, il che significa che per la sterilizzazione è possibile utilizzare una temperatura inferiore (da 121 °C a 134 °C) e un tempo più breve (da 3 a 15 minuti). Il punto di ebollizione dell’acqua a pressione atmosferica è di 100 °C, temperatura insufficiente per la sterilizzazione. Pertanto, il vapore deve essere generato in un ambiente pressurizzato, il che eleva il punto di ebollizione dell’acqua alla temperatura richiesta. 

Gli oggetti in grado di sopportare una temperatura pari o inferiore a 134 °C possono essere sterilizzati con il vapore, ma devono essere in grado di resistere a una combinazione di temperatura, umidità e pressione. Per quelli che ne sono in grado, la sterilizzazione a vapore rappresenta una forma di sterilizzazione altamente efficace e penetrante.

Sintesi

La scelta definitiva in materia di sterilizzazione non è semplice. Tuttavia, è possibile districarsi tra le complessità e individuare l’opzione più adeguata concentrandosi in particolare sugli oggetti in questione e sulle condizioni richieste dopo la sterilizzazione.

La filtrazione costituisce una soluzione efficace per la sterilizzazione di un numero limitato di liquidi, in particolare per quelli sensibili al calore, alle radiazioni e ai metodi chimici. Tuttavia, è necessario considerare che tale approccio richiede l’integrazione con altre forme di sterilizzazione per garantire l’inattivazione dei microrganismi.

Comprendendo molteplici varianti con diverse capacità di penetrazione, la radiazione rappresenta una valida opzione qualora i materiali siano sensibili al calore e in grado di resistere ai suoi effetti dannosi. Tuttavia, la sua implementazione è costosa e la sua convenienza economica dipende dalla scala di utilizzo.

La sterilizzazione chimica, pur presentando problemi di tossicità, residui e logistica, oltre a costi ricorrenti per i materiali di consumo, rimane l’unica opzione quando l’oggetto da sterilizzare è incompatibile con altre tecniche – ad esempio un materiale solido sensibile al calore e alle radiazioni.

Per carichi non sensibili a calore, umidità e — entro certi limiti — pressione, la sterilizzazione a vapore si conferma spesso la soluzione più indicata, in quanto offre economicità, efficacia e rapidità. Lo stesso principio vale per i materiali di scarto, per i quali le condizioni post-sterilizzazione non sono rilevanti. L’autoclave rimane pertanto un’attrezzatura essenziale per quasi tutti i laboratori, mentre i sistemi di decontaminazione degli effluenti a vapore (EDS) rappresentano una soluzione efficace per lo smaltimento di rifiuti liquidi biologicamente attivi. Per ulteriori informazioni sulla sterilizzazione termica a vapore, contattate Astell Scientific all’indirizzo Info@Astell.com.  

Attraverso l’analisi del materiale da sterilizzare, è possibile individuare la tecnica di sterilizzazione che meglio si adatta al modello ideale. È possibile valutare, in base alla situazione richiesta, una combinazione di velocità, efficacia, compatibilità con il materiale, atossicità, adattabilità e monitorabilità, oltre alla capacità di superare eventuali resistenze che potrebbero presentarsi nel materiale di destinazione. Naturalmente, il rapporto costo-efficacia costituirà un fattore chiave per la maggior parte delle organizzazioni.

Riferimenti

1. Schneider, P. (1994). Alternative di sterilizzazione a bassa temperatura negli anni ’90. Tappi Journal; (Stati Uniti), 77(1).

2. Rutala, William A. e David J. Weber. «Efficacia clinica delle tecnologie di sterilizzazione a bassa temperatura». Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (giugno 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Consultato il 26 settembre 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). «Ultramicrobatteri: formazione del concetto e contributo degli ultramicrobatteri alla biologia». Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (aprile 1997). «Nuovi ultramicrobatteri anaerobici appartenenti al lignaggio dei Verrucomicrobiales, isolati mediante coltura a diluizione da terreno anossico di risaia». Microbiologia applicata e ambientale. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Rischi legati all’uso della sterilizzazione mediante radiazioni gamma: il rovescio della medaglia. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Pubblicato il 18 gennaio 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell e Connor, J. (2011). Sterilizzazione dei biomateriali di origine sintetica e biologica. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J. e Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Linee guida per la disinfezione e la sterilizzazione degli strumenti medici contaminati da prioni. *Infect Control Hosp Epidemiol*, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inattivazione dell’infettività dei prioni mediante raggi ionizzanti. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Tendenze future nella sterilizzazione dei biomateriali e dei dispositivi medici. In Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (pp. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Dipartimento del Lavoro degli Stati Uniti, 2020. Ossido di etilene. [online] Amministrazione per la sicurezza e la salute sul lavoro. Disponibile all’indirizzo: [Consultato il 25 settembre 2020].

12. National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem Compound Summary for CID 6354, Ethylene oxide. Retrieved September 23, 2020 from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide.

13. Cdc.gov (2020) Plasma di perossido di idrogeno gassoso | Linee guida per la disinfezione e la sterilizzazione | Archivio delle linee guida | Controllo delle infezioni. Consultato il 27 settembre 2020 all’indirizzo https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilizzazione a vapore e a calore secco di biomateriali e dispositivi medici. In Sterilizzazione di biomateriali e dispositivi medici (pp. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Trattamento termico delle proteine alimentari.

16. Vinny R. Sastri (2014). Requisiti dei materiali per le materie plastiche utilizzate nei dispositivi medici, in «Plastics in Medical Devices» (seconda edizione).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L. e Taloumis, L. J. (2002). Effetto della sterilizzazione a vapore rispetto a quella a calore secco sull’usura delle pinze ortodontiche per il taglio delle legature. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467-471.

Pubblicato per la prima volta su Labmate UK & Ireland, Volume 45, Numero 7.