Alcançando a assepsia — Escolha de um procedimento de esterilização.

A esterilização de microrganismos e de material biológico é um pré-requisito tanto para o controle experimental quanto para o controle ambiental em laboratórios de inúmeras disciplinas. 

Seja para garantir condições assépticas em uma placa de cultura ou para manter uma área de biocontenção, o objetivo da esterilização é sempre a erradicação de agentes biológicos indesejados. Esse objetivo pode ser alcançado por meio de diversos procedimentos, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens.

O processo de esterilização ideal precisa funcionar de forma rápida e eficaz, inativando microrganismos e material biológico indesejado, como príons. Deve também garantir toxicidade mínima, riscos mínimos à saúde dos operadores e alterações mínimas nos objetos esterilizados, ao mesmo tempo em que oferece máxima adaptabilidade — acomodando diferentes materiais. O procedimento também deve ser capaz de superar qualquer resistência física à esterilização demonstrada pelos materiais a serem esterilizados. Idealmente, tudo isso deve ser alcançado de forma economicamente viável, permitindo monitoramento consistente [1] [2]. 

No entanto, atender a todas essas condições é frequentemente impraticável. Consequentemente, a incorporação de muitos desses fatores costuma ser uma preocupação secundária, dependendo da situação e da necessidade, sendo o objetivo principal alcançar a assepsia em um produto final funcional. A seguir, apresenta-se uma avaliação dos métodos de esterilização comumente disponíveis, bem como seus pontos positivos e negativos.

Filtração Estéril

Quando se trata de esterilizar fluidos, a filtração é uma alternativa a considerar. Um líquido ou gás pode ser passado por uma membrana filtrante esterilizante, que forma uma barreira mecânica contra todas as partículas de diâmetro superior ao dos poros da membrana. Microorganismos maiores do que os poros são retidos atrás do filtro, garantindo que não possam entrar no filtrado. 

O calor, a radiação e os agentes químicos atuam alterando as estruturas físicas das moléculas e das organelas dentro dos microrganismos — um processo que também pode alterar os componentes estruturais de substâncias mais sensíveis. A filtração não produz tais efeitos, limitando-se a remover partículas acima de um determinado tamanho. Dessa forma, a filtração constitui uma opção plausível para fluidos mais instáveis e reativos.

Ao contrário de outros métodos de esterilização, a filtração não inativa os microrganismos. Por isso, são necessários procedimentos complementares de esterilização — frequentemente calor ou radiação — para esterilizar o filtro e os resíduos após o processamento.

Também é necessário prestar muita atenção ao tamanho dos poros do filtro. Frequentemente, utiliza-se um tamanho de poro de 0,2 μm — e, considerando que o menor micoplasma mede cerca de 0,3 μm —, isso é suficiente para filtrar a maioria das bactérias. No entanto, as ultramicobactérias podem medir menos de 0,1 μm [3] [4] [5], enquanto vírus e príons costumam ser ainda menores. Reduzir o tamanho dos poros para 0,001 μm garante que menos entidades microbiológicas possam entrar no filtrado, embora isso se torne cada vez mais restritivo para os fluidos que podem ser filtrados. Uma diminuição no tamanho dos poros também aumenta o tempo de processamento — um filtro com poros de 0,1 μm terá cerca de 40% da vazão de um filtro com poros de 0,2 μm.

Radiação

Como agente esterilizante, a radiação assume diversas formas. Considere, por exemplo, os agentes esterilizantes por radiação ionizante, incluindo raios X, raios gama e feixes de elétrons. Essas tecnologias esterilizam por meio da excitação eletromagnética de partículas na área a ser esterilizada, fazendo com que elas liberem radicais livres. Esses radicais combinam-se com as ligações duplas nas biomoléculas (como DNA, RNA e enzimas), alterando sua forma, interrompendo seu funcionamento e levando à inatividade dos microrganismos que as contêm. Os esterilizantes por radiação não ionizante atuam provocando a formação de novas ligações — dímeros de pirimidina — entre as bases nucleicas do DNA, o que — assim como na radiação ionizante — altera a estrutura da macromolécula e interrompe seu funcionamento. 

Devido à sua funcionalidade, os esterilizantes por radiação podem degradar substâncias químicas orgânicas, como plásticos [6] [7], e material biológico. Infelizmente, seus efeitos degradativos não se estendem aos príons, que permanecem, em grande parte, estáveis demais para serem afetados por esterilizantes por radiação. [8] No entanto, vale ressaltar que alguns estudos apontam para a possibilidade de desnaturação de príons por meio da radiação gama [9]. 

Outra consideração importante é que a capacidade de penetração e os tempos de processamento dos esterilizantes por radiação variam significativamente.  A luz ultravioleta (UV) só é capaz de penetrar em materiais transparentes, o que a torna um esterilizante viável para o ar e para a água purificada por osmose reversa, mas limita-se a um esterilizante de superfície para substâncias opacas. O tempo de processamento da luz UV também pode se estender por horas, como é o caso dos raios X e da radiação gama. No entanto, esses dois últimos métodos trazem suas próprias vantagens. 

Os raios gama e os raios X são altamente penetrantes, o que significa que podem ser utilizados para esterilizar objetos contidos em recipientes que, de outra forma, seriam impermeáveis. O principal diferencial da esterilização por feixe de elétrons é a esterilização quase instantânea. Frequentemente, ela é utilizada como esterilizante de superfície devido à baixa capacidade de penetração das partículas de elétrons — no entanto, com energia suficiente, ela também pode penetrar profundamente na matéria.

Os custos operacionais dos raios X, do feixe de elétrons e dos raios UV podem ser relativamente baixos, sendo o uso eficiente de eletricidade uma característica comum a todos eles. Os equipamentos de raios X, feixe de elétrons e raios gama apresentam um alto custo inicial de investimento [10]. A esterilização por raios gama apresenta um custo contínuo associado à substituição de sua fonte de radiação, geralmente o isótopo cobalto-60. Deve-se, no entanto, reconhecer que, embora os operadores devam estar sempre protegidos contra os efeitos nocivos de todos os esterilizantes por radiação, a presença física de material radioativo nos esterilizadores por raios gama implica que precauções adicionais devem ser tomadas durante a manutenção do equipamento.    

Química

Os esterilizantes químicos abrangem uma ampla gama de líquidos e gases com uma característica comum: sua capacidade de destruir a vida microbiana. Devido a essas características, eles costumam ser prejudiciais aos seres humanos, quando não letais. O esterilizante químico mais comumente utilizado — o óxido de etileno — pode causar dores de cabeça, náuseas, vômitos, diarreia, falta de ar, irritação respiratória, lesão pulmonar e cianose a curto prazo, enquanto a exposição a longo prazo está associada à ocorrência de câncer, alterações mutagênicas, neurotoxicidade e sensibilização [11]. 

O gás óxido de etileno esteriliza por meio da alquilação de proteínas, DNA e RNA, o que torna os microrganismos inviáveis [7]. Esse processo ocorre em função da alta reatividade do composto; uma característica que leva a complicações logísticas. Devido à combinação de sua toxicidade e inflamabilidade, recomenda-se que o óxido de etileno seja armazenado em uma unidade de armazenamento separada — com uma zona de isolamento de 100 m de raio estabelecida para o caso de um vazamento [12]. 

Assim como a maioria dos esterilizantes químicos, o óxido de etileno é ineficaz contra príons e pode deixar resíduos nas superfícies esterilizadas. Seu tempo de esterilização também é longo — entre 2 e 5 horas — e seu tempo de processamento é ainda mais prolongado; frequentemente superior a 14 horas devido à remoção do vapor pós-esterilização. No entanto, possui alta capacidade de penetração, atua em baixas temperaturas (entre 29 e 65 °C) e não reage com a maioria dos plásticos.  

Outro avanço interessante nessa área é a esterilização por plasma gasoso. O plasma gasoso de peróxido de hidrogênio é criado pela excitação do vapor de peróxido de hidrogênio por meio de um campo elétrico, fazendo com que ele libere radicais livres que desnaturam materiais biológicos, assim como no procedimento de radiação ionizante. O plasma de gás de peróxido de hidrogênio tem se mostrado eficaz contra príons, opera em baixas temperaturas (37–44 °C) e possui um tempo de ciclo inferior a 75 minutos [13]. No entanto, o processo apresenta baixa capacidade de penetração, e o peróxido de hidrogênio utilizado é uma substância tóxica e explosiva.

Calor

A esterilização por calor é o método mais antigo e simples de esterilização, apresentando-se em duas formas: a seco e a vapor. Os principais benefícios da esterilização por calor incluem sua capacidade de destruir todo o material biológico (incluindo príons), sem deixar contaminantes ou resíduos [14]. Outro benefício é o baixo custo, especialmente no que diz respeito aos consumíveis: no máximo, são necessários apenas eletricidade e água. Os riscos relacionados à esterilização por calor também são baixos, embora haja risco de queimaduras ao tocar em objetos esterilizados quentes. 

A esterilização por calor atua primeiro nas superfícies externas do objeto a ser esterilizado e, em seguida, se espalha para o interior até que todo o material tenha sido esterilizado. O calor desnatura as proteínas presentes em microrganismos e material biológico, incluindo príons, que também são proteínas. Esse processo altera as ligações de hidrogênio e dissulfeto, bem como as pontes salinas, modificando a estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas, tornando-as inativas para processos biológicos [15].

A esterilização por calor seco envolve a criação de um ambiente com temperatura entre 160 °C e 170 °C e a manutenção dessa temperatura por um período de duas a quatro horas. Essa combinação de tempo e temperatura significa que a esterilização de materiais sensíveis ao calor, como plásticos, por meio desse método é inviável sem que ocorra degradação do material [16]. As lâminas têm sido tradicionalmente esterilizadas com calor seco, pois há receios de que o vapor possa embotá-las. No entanto, estudos demonstraram que lâminas de aço inoxidável esterilizadas com vapor apresentam um embotamento insignificante [17].

A esterilização a vapor é um processo mais rápido e que requer menos calor do que a esterilização por calor seco. O vapor transfere energia térmica de forma mais eficaz do que o ar quente, o que significa que uma temperatura mais baixa (121 °C – 134 °C) e um tempo mais curto (3 a 15 minutos) podem ser utilizados para a esterilização. O ponto de ebulição da água à pressão atmosférica é de 100 °C, temperatura considerada baixa demais para o processo de esterilização. Por isso, o vapor deve ser gerado em um ambiente pressurizado, o que eleva o ponto de ebulição da água até a temperatura necessária. 

Objetos que suportam temperaturas de até 134 °C podem ser esterilizados com vapor, mas devem ser capazes de resistir a uma combinação de temperatura, umidade e pressão. Para aqueles que o permitem, a esterilização a vapor constitui uma forma altamente eficaz e penetrante de esterilização.

Resumo

A conclusão final sobre a esterilização não é simples. No entanto, é possível orientar-se em meio às complexidades e encontrar a opção correta, mantendo o foco principal nos objetos em questão e nas condições exigidas após a esterilização.

A filtração constitui uma excelente opção para a esterilização de um número limitado de fluidos — especialmente aqueles sensíveis ao calor, à radiação e à esterilização química. Contudo, as decisões devem ser tomadas com a consciência de que esse método depende de outras formas de esterilização para inativar os microrganismos por meio de seu mecanismo.

Abrangendo múltiplas variantes com diferentes capacidades de penetração, a radiação é uma boa opção se os materiais forem sensíveis ao calor e puderem suportar seus efeitos prejudiciais. No entanto, sua implantação é cara e depende da escala de uso para ser economicamente viável.

A esterilização química, embora envolva preocupações com toxicidade, resíduos e logística, além de custos contínuos com consumíveis, tem seu papel quando o objeto a ser esterilizado é incompatível com outras técnicas — por exemplo, um material sólido sensível ao calor e à radiação.

Para objetos que não são sensíveis ao calor, à umidade e — até certo ponto — à pressão, a esterilização a vapor costuma se destacar como a melhor opção, oferecendo economia, eficácia e rapidez. O mesmo se aplica aos resíduos, cujo estado após a esterilização não é motivo de preocupação. Assim, a autoclave continua a ser um equipamento essencial para quase todos os laboratórios, enquanto os sistemas de descontaminação de efluentes aquecidos a vapor (EDS) oferecem uma excelente opção para aqueles que precisam descartar resíduos líquidos biologicamente ativos. Entre em contato com a Astell Scientific pelo e-mail Info@Astell.com caso necessite de mais informações sobre a esterilização térmica a vapor.  

Por meio da análise do material a ser esterilizado, é possível identificar a técnica de esterilização que melhor se adapta ao modelo ideal. Uma combinação de velocidade, eficácia, compatibilidade com o material, não toxicidade, adaptabilidade e capacidade de monitoramento pode ser avaliada para a situação em questão, juntamente com a capacidade de superar qualquer resistência que possa ser encontrada no material alvo. É claro que a relação custo-benefício será um fator-chave na maioria das organizações.

Referências

1. Schneider, P. (1994). Alternativas de esterilização a baixa temperatura na década de 1990. Tappi Journal; (Estados Unidos), 77(1).

2. Rutala, William A., e David J. Weber. “Eficácia clínica das tecnologias de esterilização a baixa temperatura.” Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (junho de 2003). Enciclopédia das Ciências da Vida. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Acessado em 26 de setembro de 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). “Ultramicrobactérias: formação do conceito e contribuição das ultramicrobactérias para a biologia”. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (abril de 1997). “Novas ultramicrobactérias anaeróbicas pertencentes à linhagem Verrucomicrobiales, isoladas por cultura de diluição a partir de solo anóxico de arrozais”. Microbiologia Aplicada e Ambiental. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Riscos do uso da esterilização por radiação gama: o outro lado da moeda. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Publicado em 18 de janeiro de 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell e Connor, J. (2011). Esterilização de biomateriais de origem sintética e biológica. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Sociedade Americana de Epidemiologia em Saúde. (2010). Diretriz para a desinfecção e esterilização de instrumentos médicos contaminados por príons. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inativação da infectividade dos príons por raios ionizantes. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Tendências futuras para a esterilização de biomateriais e dispositivos médicos. Em Esterilização de Biomateriais e Dispositivos Médicos (pp. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Departamento do Trabalho dos Estados Unidos, 2020. Óxido de etileno. [online] Administração de Segurança e Saúde Ocupacional. Disponível em: [Acessado em 25 de setembro de 2020].

12. Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (2020). Resumo do composto PubChem para CID 6354, óxido de etileno. Recuperado em 23 de setembro de 2020 de https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide.

13. Cdc.gov (2020) Plasma de gás de peróxido de hidrogênio | Diretrizes de desinfecção e esterilização | Biblioteca de diretrizes | Controle de infecções. Recuperado em 27 de setembro de 2020, de https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Esterilização por vapor e calor seco de biomateriais e dispositivos médicos. Em Esterilização de Biomateriais e Dispositivos Médicos (pp. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Tratamento térmico de proteínas alimentares.

16. Vinny R. Sastri (2014). Requisitos de materiais para plásticos utilizados em dispositivos médicos, em Plásticos em Dispositivos Médicos (2ª edição).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Efeito da esterilização a vapor versus a calor seco no desgaste de alicates ortodônticos para corte de ligaduras. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, 121(5), 467-471.

Publicado originalmente na revista Labmate UK & Ireland, Volume 45, Edição 7.