Doseganje aseptičnosti – izbira postopka sterilizacije.

Sterilizacija mikroorganizmov in biološkega materiala je predpogoj za eksperimentalni nadzor in nadzor okolja v laboratorijih številnih disciplin. 

Ne glede na to, ali gre za zagotavljanje aseptičnih pogojev v kultivacijski plošči ali vzdrževanje območja biološke varnosti, je cilj sterilizacije vedno izkoreninjenje neželenih bioloških dejavnikov. Ta cilj je mogoče doseči z različnimi postopki, od katerih ima vsak svoje prednosti in pomanjkljivosti.

Idealni sterilizacijski postopek mora delovati hitro in učinkovito ter onesposobiti mikroorganizme in neželeno biološko gradivo, kot so prioni. Prav tako mora zagotoviti minimalno toksičnost, tveganje za zdravje osebja in spremembe na steriliziranih predmetih, hkrati pa omogočati največjo prilagodljivost – upoštevati različne materiale. Postopek mora biti sposoben premagati tudi morebitno fizično odpornost proti sterilizaciji, ki jo kažejo materiali, ki se sterilizirajo. Vse to bi bilo v idealnem primeru treba doseči na stroškovno učinkovit način, ki omogoča tudi dosledno spremljanje [1] [2]. 

Izpolnjevanje vseh teh pogojev pa je pogosto neizvedljivo. Zato je upoštevanje mnogih od teh dejavnikov pogosto drugotnega pomena, odvisno od situacije in nujnosti, pri čemer je glavni cilj doseganje aseptičnosti v funkcionalnem končnem izdelku. V nadaljevanju sledi ocena splošno dostopnih metod sterilizacije ter njihovih prednosti in slabosti.

Sterilna filtracija

Pri sterilizaciji tekočin je filtracija ena od metod, ki jo je treba upoštevati. Tekočino ali plin je mogoče speljati skozi sterilizacijsko filtrirno membrano, ki tvori mehansko pregrado za vse delce, katerih premer je večji od por v membrani. Mikroorganizmi, ki so večji od por, ostanejo ujeti za filtrom, kar zagotavlja, da ne morejo vstopiti v filtrat. 

Toplota, sevanje in kemična sterilizacijska sredstva delujejo tako, da spremenijo fizikalne strukture molekul in organelov znotraj mikroorganizmov – proces, ki lahko spremeni tudi strukturne sestavine občutljivejših snovi. Filtracija nima takšnih učinkov, temveč le odstrani delce, večje od določene velikosti. Zato je filtracija smiselna izbira za bolj nestabilne in reaktivne tekočine.

Za razliko od drugih metod sterilizacije filtracija ne deaktivira mikrobioloških organizmov. Zato so za sterilizacijo filtra in ostankov po obdelavi potrebni drugi postopki sterilizacije – pogosto toplota ali sevanje.

Posebno pozornost je treba posvetiti tudi velikosti por v filtru. Pogosto se uporablja velikost por 0,2 μm – in ker je najmanjša mikoplazma velika okoli 0,3 μm – to zadostuje za odfiltriranje večine bakterij. Vendar pa lahko ultramikrobakterije merijo manj kot 0,1 μm [3] [4] [5], medtem ko so virusi in prioni pogosto še manjši. Zmanjšanje velikosti por na 0,001 μm zagotavlja, da v filtrat vstopi manj mikrobioloških organizmov, čeprav to postaja vse bolj omejujoče za tekočine, ki jih je mogoče filtrirati. Zmanjšanje velikosti por podaljša tudi čas obdelave – filter s porami velikosti 0,1 μm bo imel približno 40 % pretoka v primerjavi s filtrom s porami velikosti 0,2 μm.

Sevanje

Kot sterilizacijsko sredstvo se sevanje pojavlja v več oblikah. Vzemimo na primer sterilizacijska sredstva z ionizirajočim sevanjem, vključno z rentgenskimi žarki, gama žarki in elektronskimi žarki. Te tehnologije sterilizirajo z elektromagnetnim vzbujanjem delcev v območju, ki se sterilizira, kar povzroči, da ti sproščajo proste radikale. Ti radikali se vežejo z dvojnimi vezmi v biomolekulah (kot so DNA, RNA in encimi), spreminjajo njihovo obliko, preprečujejo njihovo delovanje in povzročajo neaktivnost mikroorganizmov, ki jih vsebujejo. Sterilizanti z neionizirajočim sevanjem delujejo tako, da med nukleobazami v DNA povzročajo nastajanje novih vezi – pirimidinskih dimerov –, kar – podobno kot pri ionizirajočem sevanju – spremeni strukturo makromolekule in prepreči njeno delovanje. 

Zaradi svojega delovanja lahko sterilizanti na osnovi sevanja razgrajujejo organske kemikalije, kot so plastika [6] [7], in biološki material. Na žalost se njihovi razgrajevalni učinki ne razširjajo na prione, ki ostajajo v veliki meri preveč stabilni, da bi jih sterilizanti na osnovi sevanja lahko prizadeli. [8] Vendar je vredno omeniti, da nekatere študije kažejo na možnost denaturacije prionov z gama sevanjem [9]. 

Pomembno je tudi upoštevati, da se penetracijska sposobnost in časi obdelave sterilizantov na osnovi sevanja znatno razlikujejo.  Ultravijolična svetloba (UV) lahko prodre le skozi prosojne materiale, kar jo naredi za primerno sredstvo za sterilizacijo zraka in prečiščene vode iz reverzne osmoze, pri neprosojnih snoveh pa je omejena na površinsko sterilizacijo. Čas obdelave z UV-svetlobo lahko prav tako traja več ur, podobno kot pri rentgenskih žarkih in gama-sevanju. Vendar pa imata ti dve zadnji metodi svoje prednosti. 

Gama- in rentgenski žarki imajo visoko penetracijsko sposobnost, kar pomeni, da se lahko uporabljajo za sterilizacijo predmetov, ki so shranjeni v sicer neprepustnih posodah. Glavna prednost sterilizacije z elektronskim žarkom je skoraj takojšnja sterilizacija. Pogosto se uporablja kot sredstvo za površinsko sterilizacijo zaradi slabe penetracijske sposobnosti elektronskih delcev – vendar pa lahko ob zadostni energiji tudi globoko prodre v snov.

Tekoči stroški za rentgensko sevanje, elektronski žarek in UV-sevanje so lahko relativno nizki, saj je učinkovita raba električne energije značilnost vseh treh metod. Oprema za rentgensko sevanje, elektronski žarek in gama-sevanje ima visoke začetne naložbe [10]. Gamaststerilizacija ima tekoče stroške, povezane z zamenjavo vira sevanja, ki je običajno izotop kobalt-60. Vendar je treba upoštevati, da morajo biti operaterji sicer vedno zaščiteni pred škodljivimi učinki vseh sterilizatorjev, ki delujejo na podlagi sevanja, vendar pa fizična prisotnost radioaktivnega materiala v gamaststerilizatorjih pomeni, da je treba med vzdrževanjem naprave sprejeti dodatne varnostne ukrepe.    

Kemična

Kemična sterilizacijska sredstva zajemajo široko paleto tekočin in plinov z eno skupno lastnostjo – njihovo sposobnostjo uničevanja mikrobnega življenja. Zaradi teh lastnosti so pogosto škodljiva za ljudi, če ne celo smrtna. Najpogosteje uporabljeno kemično sterilizacijsko sredstvo – etilenoksid – lahko kratkoročno povzroča glavobole, slabost, bruhanje, drisko, zasoplost, draženje dihal, poškodbe pljuč in cianozo, medtem ko je dolgoročna izpostavljenost povezana s pojavom raka, mutagenimi spremembami, nevrotoksičnostjo in senzibilizacijo [11]. 

Etilenoksidni plin sterilizira z alkilacijo beljakovin, DNK in RNK, kar povzroči, da mikroorganizmi postanejo neživljeni [7]. Ta proces poteka zaradi visoke reaktivnosti te spojine; ta lastnost povzroča logistične zaplete. Zaradi kombinacije njegove strupenosti in vnetljivosti se priporoča, da se etilen oksid skladišči v ločenem skladiščnem prostoru – z vzpostavljeno izolacijsko cono s polmerom 100 m za primer uhajanja [12]. 

Tako kot večina kemičnih sterilizantov etilen oksid ni učinkovit proti prionom in lahko na steriliziranih površinah pusti ostanke. Tudi čas sterilizacije je dolg – med 2 in 5 urami –, čas obdelave pa še daljši; pogosto traja več kot 14 ur zaradi odstranjevanja hlapov po sterilizaciji. Kljub temu ima visoko penetracijsko sposobnost, deluje pri nizkih temperaturah (med 29–65 °C) in ne reagira z večino plastike.  

Še en zanimiv napredek na tem področju je sterilizacija s plinsko plazmo. Plinska plazma iz vodikovega peroksida nastane z vzbujanjem hlapov vodikovega peroksida z električnim poljem, kar povzroči nastajanje prostih radikalov, ki denaturirajo biološke snovi, podobno kot pri postopku z ionizirajočim sevanjem. Plasma vodikovega peroksida se je izkazala za učinkovito proti prionom, deluje pri nizkih temperaturah (37–44 °C) in ima čas cikla krajši od 75 minut [13]. Vendar pa ima postopek slabo penetracijsko sposobnost, poleg tega pa je vodikov peroksid, na katerem temelji, strupena in eksplozivna snov.

Toplota

Sterilizacija s toploto je najstarejša in najpreprostejša oblika sterilizacije, ki se izvaja v dveh oblikah – suha in s paro. Ključne prednosti sterilizacije s toploto vključujejo njeno sposobnost uničenja vseh bioloških snovi (vključno s prioni), pri čemer ne pušča onesnaževalcev ali ostankov [14]. Druga prednost so nizki stroški, zlasti kar zadeva potrošni material: potrebni sta največ le elektrika in voda. Tveganja, povezana s toplotno sterilizacijo, so prav tako nizka, čeprav obstaja nevarnost opeklin ob dotiku vročih steriliziranih predmetov. 

Toplotna sterilizacija najprej vpliva na zunanje površine predmeta, ki se sterilizira, nato pa se širi navznoter, dokler ni steriliziran celoten material. Toplota denaturira beljakovine, ki se nahajajo v mikroorganizmih in biološkem materialu, in ker so prioni beljakovine, nanje vpliva tudi toplotna sterilizacija. Proces denaturacije spreminja vodikove in disulfidne vezi ter solne mostove ter spreminja sekundarno, terciarno in kvartarno strukturo beljakovin, zaradi česar postanejo neuporabne za biološke procese [15].

Sterilizacija s suho toploto vključuje ustvarjanje okolja s temperaturo od 160 °C do 170 °C in njeno vzdrževanje v obdobju od dveh do štirih ur. Ta kombinacija časa in temperature pomeni, da sterilizacija toplotno občutljivih materialov, kot so plastike, s to metodo ni izvedljiva brez degradacije materiala [16]. Rezila se tradicionalno sterilizirajo s suho toploto, saj obstajajo pomisleki, da bi jih para otupila. Vendar so študije pokazale, da pri rezilih iz nerjavečega jekla, steriliziranih s paro, pride do zanemarljivega otupevanja [17].

Sterilizacija s paro je hitrejši in toplotno manj intenziven postopek kot sterilizacija s suho toploto. Para prenaša toplotno energijo učinkoviteje kot vroč zrak, kar pomeni, da je za sterilizacijo mogoče uporabiti nižjo temperaturo (121 °C – 134 °C) in krajši čas (3 do 15 minut). Vrelišče vode pri atmosferskem tlaku znaša 100 °C, kar je za sterilizacijski postopek premajhna temperatura. Zato je treba paro ustvariti v okolju pod tlakom, kar dvigne vrelišče vode na zahtevano temperaturo. 

Predmeti, ki prenesejo toploto do 134 °C, se lahko sterilizirajo s paro, vendar morajo biti odporni na kombinacijo temperature, vlage in tlaka. Za tiste, ki to zmorejo, je sterilizacija s paro zelo učinkovita in globoko prodorna oblika sterilizacije.

Povzetek

Končni zaključek glede sterilizacije ni enostaven. Vendar je mogoče najti pot skozi zapletenost in izbrati pravo možnost, če se osredotočimo predvsem na zadevne predmete in njihovo zahtevano stanje po sterilizaciji.

Filtracija je primerna rešitev za omejeno število tekočin, zlasti za tiste, ki so občutljive na toploto, sevanje in kemično sterilizacijo. Pri odločanju je treba upoštevati, da je ta metoda odvisna od drugih oblik sterilizacije za inaktivacijo mikroorganizmov v svojem delovnem mehanizmu.

Sevanje, ki zajema več različic z različnimi sposobnostmi prodiranja, je dobra možnost, če so materiali občutljivi na toploto in lahko prenesejo njegove škodljive učinke. Vendar je vzpostavitev draga, stroškovna učinkovitost pa je odvisna od obsega uporabe.

Kemična sterilizacija, čeprav je povezana s toksičnostjo, ostanki in logističnimi težavami ter stalnimi stroški potrošnega materiala, ima svojo vlogo, kadar je predmet, ki se sterilizira, nezdružljiv z drugimi sterilizacijskimi tehnikami – na primer trden material, občutljiv na toploto in sevanje.

Za predmete, ki niso občutljivi na toploto, vlago in – do neke mere – na tlak, se pogosto kot najboljša izbira izkaže sterilizacija s paro, saj ponuja stroškovno učinkovitost, učinkovitost in hitrost. To velja tudi za odpadne snovi, pri katerih stanje po sterilizaciji ni pomembno. Zato avtoklav ostaja nepogrešljiva oprema za skoraj vse laboratorije, medtem ko sistemi za dekontaminacijo odplak s parnim ogrevanjem (EDS) predstavljajo odlično možnost za tiste, ki morajo odstraniti biološko aktivne tekoče odpadke. Za dodatne informacije o sterilizaciji s paro se obrnite na podjetje Astell Scientific prek Info@Astell.com.  

Z analizo materiala, ki se sterilizira, je mogoče najti sterilizacijsko tehniko, ki najbolje ustreza idealnemu modelu. Za zahtevano situacijo je mogoče oceniti kombinacijo hitrosti, učinkovitosti, združljivosti z materialom, netoksičnosti, prilagodljivosti in možnosti spremljanja, skupaj z zmožnostjo premagovanja morebitne odpornosti ciljnega materiala. Seveda bo stroškovna učinkovitost ključni dejavnik v večini organizacij.

Viri

1. Schneider, P. (1994). Alternativne metode nizkotemperaturne sterilizacije v 90. letih. Tappi Journal; (Združene države Amerike), 77(1).

2. Rutala, William A., in David J. Weber. »Klinična učinkovitost tehnologij nizkotemperaturne sterilizacije.« Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (junij 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Pridobljeno 26. septembra 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). »Ultramikrobakterije: Oblikovanje koncepta in prispevek ultramikrobakterij k biologiji«. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (april 1997). »Nove anaerobne ultramikrobakterije, ki pripadajo liniji Verrucomicrobiales bakterijskega porekla, izolirane z razredčitveno kulturo iz anoksične riževske prsti«. Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Tveganja pri uporabi sterilizacije z gama-sevanjem: druga stran kovanca. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Objavljeno 18. januarja 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell in Connor, J. (2011). Sterilizacija biomaterialov sintetičnega in biološkega izvora. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Društvo za epidemiologijo v zdravstvu Amerike. (2010). Smernice za dezinfekcijo in sterilizacijo medicinskih instrumentov, onesnaženih s prioni. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inaktivacija prionske infektivnosti z ionizirajočim sevanjem. Radiation Physics and Chemistry, 76(11–12), 1760–1762.

10. Simmons, A. (2012). Prihodnji trendi na področju sterilizacije biomaterialov in medicinskih pripomočkov. V: Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (str. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Ministrstvo za delo Združenih držav Amerike, 2020. Etilenoksid. [spletno] Uprava za varnost in zdravje pri delu. Na voljo na: [Dostopano 25. septembra 2020].

12. Nacionalni center za biotehnološke informacije (2020). Povzetek spojine PubChem za CID 6354, etilenoksid. Pridobljeno 23. septembra 2020 iz https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Plazma iz plinastega vodikovega peroksida | Smernice za dezinfekcijo in sterilizacijo | Knjižnica smernic | Nadzor okužb. Pridobljeno 27. septembra 2020 iz https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilizacija biomaterialov in medicinskih pripomočkov s paro in suho toploto. V: Sterilizacija biomaterialov in medicinskih pripomočkov (str. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Toplotna obdelava beljakovin v živilih.

16. Vinny R. Sastri (2014). Zahteve glede materialov za plastiko, uporabljeno v medicinskih pripomočkih, v: Plastika v medicinskih pripomočkih (druga izdaja).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Vpliv sterilizacije s paro v primerjavi s suho toploto na obrabo ortodontskih klešč za rezanje ligatur. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics, 121(5), 467–471.

Prvič objavljeno v reviji Labmate UK & Ireland, letnik 45, številka 7.