Osiąganie aseptyki – wybór procedury sterylizacji.

Sterylizacja mikroorganizmów i materiałów biologicznych jest warunkiem koniecznym zarówno do prowadzenia eksperymentów, jak i kontroli warunków środowiskowych w laboratoriach z najróżniejszych dziedzin. 

Niezależnie od tego, czy chodzi o zapewnienie warunków aseptycznych na płytce hodowlanej, czy też o utrzymanie obszaru o ograniczonym rozprzestrzenianiu się czynników biologicznych, celem sterylizacji jest zawsze wyeliminowanie niepożądanych czynników biologicznych. Cel ten można osiągnąć za pomocą różnych procedur, z których każda ma swoje zalety i wady.

Idealny proces sterylizacji musi przebiegać szybko i skutecznie, unieszkodliwiając mikroorganizmy oraz niepożądane materiały biologiczne, takie jak priony. Powinien on również zapewniać minimalną toksyczność, minimalne ryzyko dla zdrowia operatorów oraz minimalne zmiany w sterylizowanych przedmiotach, przy jednoczesnym zapewnieniu maksymalnej elastyczności — dostosowanej do różnych materiałów. Procedura powinna również być w stanie pokonać wszelką fizyczną odporność na sterylizację wykazywana przez sterylizowane materiały. Wszystko to powinno być w idealnym przypadku realizowane w sposób ekonomiczny, co pozwala również na stały monitoring [1] [2]. 

Spełnienie wszystkich tych warunków jest jednak często niepraktyczne. W związku z tym uwzględnienie wielu z tych czynników ma często drugorzędne znaczenie w zależności od sytuacji i konieczności, a głównym celem jest osiągnięcie aseptyki w funkcjonalnym produkcie końcowym. Poniżej przedstawiono ocenę powszechnie dostępnych metod sterylizacji wraz z ich zaletami i wadami.

Filtracja sterylizacyjna

W przypadku konieczności sterylizacji materiału płynnego warto rozważyć zastosowanie filtracji. Ciecz lub gaz można przepuścić przez membranę filtra sterylizującego, która stanowi barierę mechaniczną dla wszystkich cząstek o średnicy większej niż pory w membranie. Mikroorganizmy większe od porów zostają zatrzymane za filtrem, co gwarantuje, że nie przedostaną się do filtratu. 

Sterylanty termiczne, promieniowanie oraz środki chemiczne działają poprzez zmianę struktur fizycznych cząsteczek i organelli w mikroorganizmach – proces ten może również wpływać na składniki strukturalne substancji bardziej wrażliwych. Filtracja nie wywiera takich skutków, a jedynie usuwa cząstki przekraczające określoną wielkość. W związku z tym filtracja stanowi uzasadniony wybór w przypadku płynów bardziej niestabilnych i reaktywnych.

W przeciwieństwie do innych metod sterylizacji filtracja nie dezaktywuje organizmów mikrobiologicznych. W związku z tym do sterylizacji filtra i pozostałości po procesie wymagane są inne procedury sterylizacyjne – często wykorzystujące ciepło lub promieniowanie.

Należy również zwrócić szczególną uwagę na wielkość porów w filtrze. Często stosuje się pory o wielkości 0,2 μm – a biorąc pod uwagę, że najmniejsze mykoplazmy mają około 0,3 μm – jest to wystarczające do odfiltrowania większości bakterii. Jednak ultramikrobakterie mogą mieć rozmiar mniejszy niż 0,1 μm [3] [4] [5], podczas gdy wirusy i priony są często jeszcze mniejsze. Zmniejszenie wielkości porów do 0,001 μm gwarantuje, że do filtratu przedostanie się mniej cząstek mikrobiologicznych, choć staje się to coraz bardziej nieopłacalne w przypadku płynów, które można filtrować. Zmniejszenie wielkości porów wydłuża również czas przetwarzania – filtr o wielkości porów 0,1 μm będzie charakteryzował się przepływem wynoszącym około 40% przepływu filtra o wielkości porów 0,2 μm.

Promieniowanie

Promieniowanie jako środek sterylizujący występuje w wielu postaciach. Weźmy na przykład środki sterylizujące wykorzystujące promieniowanie jonizujące, w tym promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma oraz wiązki elektronów. Technologie te sterylizują poprzez elektromagnetyczne wzbudzanie cząstek w sterylizowanym obszarze, co powoduje uwalnianie przez nie wolnych rodników. Radykalne cząsteczki te łączą się z wiązaniami podwójnymi w biomolekułach (takich jak DNA, RNA i enzymy), zmieniając ich strukturę, uniemożliwiając funkcjonowanie i prowadząc do unieszkodliwienia mikroorganizmów, w których się znajdują. Promieniowanie niejonizujące działa poprzez wywoływanie tworzenia się nowych wiązań – dimerów pirymidynowych – pomiędzy zasadami nukleinowymi w DNA, co – podobnie jak w przypadku promieniowania jonizującego – zmienia strukturę makrocząsteczki i uniemożliwia jej funkcjonowanie. 

Ze względu na swój mechanizm działania środki sterylizujące wykorzystujące promieniowanie mogą powodować degradację związków organicznych, takich jak tworzywa sztuczne [6] [7] oraz materiał biologiczny. Niestety, ich działanie degradujące nie obejmuje prionów, które pozostają w większości zbyt stabilne, by uległy oddziaływaniu środków sterylizujących wykorzystujących promieniowanie [8]. Warto jednak zauważyć, że niektóre badania wskazują na możliwość denaturacji prionów pod wpływem promieniowania gamma [9]. 

Kolejną istotną kwestią jest fakt, że zdolność penetracji oraz czas działania środków sterylizujących opartych na promieniowaniu znacznie się różnią.  Promieniowanie ultrafioletowe (UV) przenika wyłącznie przez materiały przezroczyste, co czyni je skutecznym środkiem sterylizującym dla powietrza i wody oczyszczonej metodą odwróconej osmozy, jednak w przypadku substancji nieprzezroczystych ogranicza się do sterylizacji powierzchniowej. Czas trwania procesu sterylizacji promieniowaniem UV może również wynosić wiele godzin, podobnie jak w przypadku promieni rentgenowskich i promieniowania gamma. Niemniej jednak te dwie ostatnie metody mają swoje zalety. 

Promieniowanie gamma i rentgenowskie charakteryzują się wysoką zdolnością penetracji, co oznacza, że można je stosować do sterylizacji ładunków umieszczonych w pojemnikach, które w innym przypadku byłyby nieprzepuszczalne. Główną zaletą sterylizacji wiązką elektronową jest niemal natychmiastowa sterylizacja. Często stosuje się ją jako środek do sterylizacji powierzchniowej ze względu na słabą zdolność penetracji cząstek elektronowych – jednak przy wystarczającej energii może ona również głęboko przenikać materię.

Koszty eksploatacyjne promieniowania rentgenowskiego, wiązki elektronowej i promieniowania UV mogą być stosunkowo niskie, a cechą charakterystyczną każdej z tych metod jest efektywne wykorzystanie energii elektrycznej. Urządzenia wykorzystujące promieniowanie rentgenowskie, wiązkę elektronową i promieniowanie gamma wiążą się z wysokimi początkowymi nakładami kapitałowymi [10]. Sterylizacja promieniowaniem gamma generuje bieżące koszty związane z wymianą źródła promieniowania, którym zazwyczaj jest izotop kobaltu-60. Należy jednak pamiętać, że choć operatorzy zawsze wymagają ochrony przed szkodliwym działaniem wszystkich środków sterylizujących wykorzystujących promieniowanie, fizyczna obecność materiałów radioaktywnych w sterylizatorach gamma oznacza konieczność podjęcia dodatkowych środków ostrożności podczas konserwacji urządzenia.    

Sterylizatory chemiczne

Środki sterylizujące o działaniu chemicznym obejmują szeroki zakres cieczy i gazów, których łączy jedna cecha – zdolność do niszczenia organizmów mikrobiologicznych. Ze względu na te właściwości są one często szkodliwe dla ludzi, a nawet śmiertelne. Najczęściej stosowany środek chemiczny do sterylizacji – tlenek etylenu – może w krótkim okresie powodować bóle głowy, nudności, wymioty, biegunkę, duszności, podrażnienie dróg oddechowych, uszkodzenie płuc oraz sinicę, natomiast długotrwałe narażenie wiąże się z występowaniem nowotworów, zmianami mutagennymi, neurotoksycznością oraz uczuleniem [11]. 

Tlenek etylenu w postaci gazowej sterylizuje poprzez alkilowanie białek, DNA i RNA, co prowadzi do utraty zdolności do życia przez mikroorganizmy [7]. Proces ten zachodzi w wyniku wysokiej reaktywności tego związku; cecha ta prowadzi do komplikacji logistycznych. Ze względu na połączenie toksyczności i palności zaleca się przechowywanie tlenku etylenu w oddzielnym magazynie — z wyznaczoną strefą izolacyjną o promieniu 100 m na wypadek wycieku [12]. 

Podobnie jak w przypadku większości chemicznych środków sterylizujących, tlenek etylenu jest nieskuteczny wobec prionów i może pozostawiać osad na sterylizowanych powierzchniach. Czas sterylizacji jest również długi – wynosi od 2 do 5 godzin – a czas przetwarzania jeszcze dłuższy; często przekracza 14 godzin ze względu na konieczność usuwania oparów po sterylizacji. Charakteryzuje się jednak wysoką zdolnością penetracji, działa w niskich temperaturach (od 29 do 65°C) i nie wchodzi w reakcje z większością tworzyw sztucznych.  

Kolejnym interesującym osiągnięciem w tej dziedzinie jest sterylizacja plazmą gazową. Plazma gazowa z nadtlenku wodoru powstaje w wyniku wzbudzenia oparów nadtlenku wodoru za pomocą pola elektrycznego, co powoduje wydzielanie wolnych rodników denaturujących materiały biologiczne, podobnie jak w przypadku procedury z wykorzystaniem promieniowania jonizującego. Udowodniono, że plazma gazowa nadtlenku wodoru jest skuteczna wobec prionów, działa w niskich temperaturach (37–44°C), a czas cyklu wynosi poniżej 75 minut [13]. Proces ten charakteryzuje się jednak słabą penetracją, a stosowany w nim nadtlenek wodoru jest substancją toksyczną i wybuchową.

Sterylizacja termiczna

Sterylizacja termiczna jest najstarszym i najprostszym rodzajem sterylizacji i występuje w dwóch postaciach – suchej i parowej. Do kluczowych zalet sterylizacji termicznej należy jej zdolność do niszczenia wszelkich materiałów biologicznych (w tym prionów), przy czym nie pozostawia ona żadnych zanieczyszczeń ani pozostałości [14]. Kolejną zaletą jest niski koszt, zwłaszcza w odniesieniu do materiałów eksploatacyjnych: wymagane są co najwyżej energia elektryczna i woda. Zagrożenia związane ze sterylizacją termiczną są również niewielkie, choć istnieje ryzyko poparzeń w wyniku dotknięcia gorących, wysterylizowanych przedmiotów. 

Sterylizacja termiczna oddziałuje najpierw na zewnętrzne powierzchnie sterylizowanego przedmiotu, a następnie rozprzestrzenia się do wewnątrz, aż do sterylizacji całego materiału. Ciepło powoduje denaturację białek występujących w mikroorganizmach i materiale biologicznym, a ponieważ priony są białkami, sterylizacja termiczna oddziałuje również na nie. Proces denaturacji zmienia wiązania wodorowe i disiarczkowe oraz mostki solne, a także modyfikuje strukturę drugorzędową, trzeciorzędową i czwartorzędową białek, uniemożliwiając im udział w procesach biologicznych [15].

Sterylizacja suchym ciepłem polega na wytworzeniu środowiska o temperaturze od 160°C do 170°C i utrzymaniu jej przez okres od dwóch do czterech godzin. Takie połączenie czasu i temperatury oznacza, że sterylizacja materiałów wrażliwych na ciepło, takich jak tworzywa sztuczne, przy użyciu tej metody jest niemożliwa bez spowodowania degradacji materiału [16]. Ostrza tradycyjnie sterylizowano suchym ciepłem, ponieważ istnieją obawy, że para wodna może spowodować ich stępienie. Badania wykazały jednak, że ostrza ze stali nierdzewnej sterylizowane parą wykazują znikome stępienie [17].

Sterylizacja parowa jest szybsza i wymaga niższej temperatury niż sterylizacja suchym ciepłem. Para przenosi energię cieplną efektywniej niż gorące powietrze, co oznacza, że do sterylizacji można zastosować niższą temperaturę (121°C – 134°C) oraz krótszy czas (od 3 do 15 minut). Temperatura wrzenia wody przy ciśnieniu atmosferycznym wynosi 100°C, co jest wartością zbyt niską dla procesu sterylizacji. W związku z tym para wodna musi być wytwarzana w środowisku pod ciśnieniem, co podnosi temperaturę wrzenia wody do wymaganego poziomu. 

Przedmioty, które mogą wytrzymać temperaturę 134°C lub niższą, można sterylizować parą, jednakże musza być one odporne na połączenie temperatury, wilgoci i ciśnienia. W przypadku spełnienia tych wymagań sterylizacja parowa stanowi skuteczną metodę o głębokim działaniu.

Podsumowanie

Ostateczny wybór metody sterylizacji nie jest prosty. Możliwe jest jednak poruszanie się po tej złożonej kwestii i znalezienie właściwego rozwiązania poprzez skupienie się przede wszystkim na danych przedmiotach oraz wymaganym stanie, w jakim powinny się one znaleźć po sterylizacji.

Filtracja stanowi odpowiednią opcję w przypadku sterylizacji ograniczonej ilości płynów – zwłaszcza tych wrażliwych na ciepło, promieniowanie i sterylizację chemiczną. Należy jednak pamiętać, że jej skuteczność w unieszkodliwianiu mikroorganizmów opiera się na innych metodach sterylizacji.

Promieniowanie, obejmujące wiele wariantów o różnej zdolności penetracji, stanowi dobre rozwiązanie, jeśli materiały są wrażliwe na ciepło i są w stanie wytrzymać jego szkodliwe skutki. Jednak jego wdrożenie jest kosztowne, a opłacalność zależy od skali zastosowania.

Sterylizacja chemiczna, mimo wyzwań związanych z toksycznością, pozostałościami, logistyką oraz bieżącymi kosztami eksploatacyjnymi, pozostaje metodą z wyboru w przypadku ładunków nieodpowiednich do innych technik – na przykład materiałów stałych wrażliwych na ciepło i promieniowanie.

W przypadku ładunków odpornych na ciepło, wilgoć oraz – w pewnym stopniu – ciśnienie, sterylizacja parowa często okazuje się optymalnym rozwiązaniem, zapewniając efektywność kosztową, skuteczność i szybkość. Dotyczy to również odpadów, w przypadku których stan po sterylizacji nie ma znaczenia. W związku z tym autoklaw pozostaje niezbędnym wyposażeniem niemal wszystkich laboratoriów, natomiast systemy dekontaminacji ścieków ogrzewane parą (EDS) stanowią doskonałą opcję dla podmiotów, które müssen utylizować biologicznie aktywne odpady płynne. Prosimy o kontakt z firmą Astell Scientific pod adresem Info@Astell.com, jeśli potrzebują Państwo więcej informacji na temat sterylizacji termicznej z wykorzystaniem pary.  

Analiza sterylizowanego materiału pozwala wybrać metodę najlepiej odpowiadającą wymaganiom. W zależności od sytuacji można ocenić takie czynniki jak szybkość, skuteczność, kompatybilność z materiałem, nietoksyczność, elastyczność oraz możliwość monitorowania, a także zdolność do pokonania ewentualnej odporności materiału docelowego. Oczywiście w większości organizacji kluczowym czynnikiem pozostaje opłacalność.

Bibliografia

1. Schneider, P. (1994). Alternatywne metody sterylizacji niskotemperaturowej w latach 90. XX wieku. Tappi Journal; (Stany Zjednoczone), 77(1).

2. Rutala, William A. i David J. Weber. „Skuteczność kliniczna technologii sterylizacji w niskiej temperaturze”. Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (czerwiec 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Pobrano 26 września 2017 r.

4. Duda, V.; Suzina, N.; Polivtseva, V.; Boronin, A. (2012). „Ultramikrobakterie: powstanie koncepcji i wkład ultramikrobakterii w biologię”. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (kwiecień 1997). „Nowe beztlenowe ultramikrobakterie należące do linii ewolucyjnej Verrucomicrobiales, wyizolowane metodą hodowli rozcieńczeniowej z beztlenowej gleby pól ryżowych”. Mikrobiologia Stosowana i Środowiskowa. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Ryzyko związane ze stosowaniem sterylizacji promieniowaniem gamma: druga strona medalu. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Opublikowano 18 stycznia 2018 r. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell i Connor, J. (2011). Sterylizacja biomateriałów pochodzenia syntetycznego i biologicznego. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J. oraz Amerykańskie Towarzystwo Epidemiologii Opieki Zdrowotnej (2010). Wytyczne dotyczące dezynfekcji i sterylizacji narzędzi medycznych zanieczyszczonych prionami. „Infect Control Hosp Epidemiol”, 31(2), 107–17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G. oraz Darbord, J. C. (2007). Inaktywacja zakaźności prionów za pomocą promieniowania jonizującego. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Przyszłe trendy w sterylizacji biomateriałów i wyrobów medycznych. W: Sterylizacja biomateriałów i wyrobów medycznych (s. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Departament Pracy Stanów Zjednoczonych, 2020. Tlenek etylenu. [online] Administracja Bezpieczeństwa i Higieny Pracy. Dostępne pod adresem: [Dostęp: 25 września 2020 r.].

12. Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (2020). Podsumowanie związku PubChem dla CID 6354, tlenek etylenu. Pobrano 23 września 2020 r. ze strony https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide.

13. Cdc.gov (2020) Plazma z gazowego nadtlenku wodoru | Wytyczne dotyczące dezynfekcji i sterylizacji | Biblioteka wytycznych | Kontrola zakażeń. Pobrano 27 września 2020 r. z https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterylizacja biomateriałów i wyrobów medycznych parą wodną oraz suchym ciepłem. W: Sterylizacja biomateriałów i wyrobów medycznych (s. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Obróbka cieplna białek spożywczych.

16. Vinny R. Sastri (2014). Wymagania materiałowe dotyczące tworzyw sztucznych stosowanych w wyrobach medycznych, w: „Tworzywa sztuczne w wyrobach medycznych” (wydanie drugie).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L. i Taloumis, L. J. (2002). Wpływ sterylizacji parowej w porównaniu ze sterylizacją suchym ciepłem na zużycie ortodontycznych szczypiec do cięcia ligatur. „American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics”, 121(5), 467–471.

Po raz pierwszy opublikowano w czasopiśmie „Labmate UK & Ireland”, tom 45, numer 7.