Досягнення асептичних умов — вибір методу стерилізації.

Стерилізація мікроорганізмів та біологічного матеріалу є необхідною умовою як експериментального, так і екологічного контролю в лабораторіях безлічі дисциплін. 

Незалежно від того, чи йдеться про забезпечення асептичних умов у культуральній чашці, чи про підтримання зони біологічної ізоляції, метою стерилізації завжди є знищення небажаних біологічних агентів. Цю мету можна досягти за допомогою різних процедурних методів, кожен з яких має свої переваги та недоліки.

Ідеальний процес стерилізації має бути швидким та ефективним, деактивуючи мікроорганізми та небажані біологічні матеріали, такі як пріони. Він також має забезпечувати мінімальну токсичність, мінімальні ризики для здоров’я операторів та мінімальні зміни у стерилізованих об’єктах, водночас забезпечуючи максимальну адаптивність — пристосовуючись до різних матеріалів. Процедура також має бути здатною подолати будь-який фізичний опір стерилізації, який виявляють матеріали, що піддаються стерилізації. Усе це, в ідеалі, має бути досягнуто економічно ефективним способом, що також дозволяє здійснювати постійний моніторинг [1] [2]. 

Однак дотримання всіх цих умов часто є нереальним. Відповідно, врахування багатьох із цих факторів часто відходить на другий план залежно від ситуації та необхідності, а головною метою є досягнення асептичності у функціональному кінцевому продукті. Далі наведено оцінку загальнодоступних методів стерилізації, їхніх переваг та недоліків.

Стерильна фільтрація

Якщо необхідно стерилізувати рідкий матеріал, слід розглянути варіант фільтрації. Рідину або газ можна пропускати через стерилізуючу фільтрувальну мембрану, яка утворює механічний бар’єр для всіх частинок, діаметр яких перевищує розмір пор у мембрані. Мікроорганізми, розмір яких перевищує розмір пор, затримуються за фільтром, що гарантує, що вони не потраплять у фільтрат. 

Тепло, радіація та хімічні стерилізатори діють шляхом зміни фізичної структури молекул та органел у мікроорганізмах — процес, який також може змінити структурні компоненти більш чутливих речовин. Фільтрація не має таких ефектів, а лише видаляє частинки, розмір яких перевищує певний поріг. Таким чином, фільтрація є обґрунтованим вибором для більш нестабільних та реактивних рідин.

На відміну від інших методів стерилізації, фільтрація не інактивує мікробіологічні об’єкти. Тому для стерилізації фільтра та залишків після обробки необхідні інші процедури стерилізації — найчастіше за допомогою тепла або радіації.

При цьому слід ретельно контролювати розміри пор. Найчастіше використовується пористість 0,2 мкм — достатньо для затримання переважної більшості бактерій, враховуючи, що найменша мікоплазма має розміри близько 0,3 мкм. Водночас ультрамікобактерії можуть мати розміри менше 0,1 мкм [3] [4] [5], а віруси та пріони — ще менші. Зменшення розміру пор до 0,001 мкм гарантує, що у фільтрат потрапить менше мікробіологічних об’єктів, хоча це все більше обмежує спектр рідин, які можна фільтрувати. Зменшення розміру пор також збільшує час обробки — фільтр з порами 0,1 мкм матиме приблизно 40 % пропускної здатності фільтра з порами 0,2 мкм.

Радіація

Як стерилізуючий засіб, радіація має різні форми. Наприклад, іонізуючі радіаційні стерилізатори, включаючи рентгенівські промені, гамма-промені та електронні пучки. Ці технології стерилізують шляхом електромагнітного збудження частинок у зоні, що стерилізується, змушуючи їх виділяти вільні радикали. Ці радикали з’єднуються з подвійними зв’язками в біомолекулах (таких як ДНК, РНК та ферменти), змінюючи їхню форму, зупиняючи їхню функцію та приводячи до втрати життєздатності мікроорганізмів, що їх містять. Стерилізатори на основі неіонізуючого випромінювання діють шляхом утворення нових зв’язків — піримідинових димерів — між нуклеотидними основами в ДНК, що — як і в разі іонізуючого випромінювання — змінює структуру макромолекули та зупиняє її функціонування. 

У зв’язку з цим радіаційні стерилізатори можуть розкладати органічні хімічні речовини, такі як пластмаси [6] [7], та біологічний матеріал. На жаль, їхній деградаційний ефект не поширюється на пріони, які залишаються надто стабільними, щоб піддаватися впливу радіаційних стерилізаторів [8]. Однак варто зазначити, що деякі дослідження вказують на можливість денатурації пріонів під дією гамма-випромінювання [9]. 

Ще одним важливим аспектом є те, що проникаюча здатність та час обробки стерилізуючих засобів, що використовують випромінювання, значно різняться.  Ультрафіолетове випромінювання (УФ) проникає лише через прозорі матеріали, що робить його придатним для стерилізації повітря та очищеної води, отриманої методом зворотного осмосу, але для непрозорих речовин воно обмежується поверхневою стерилізацією. Тривалість обробки УФ-випромінюванням також може сягати кількох годин, як і у випадку з рентгенівським та гамма-випромінюванням. Однак ці два останні методи мають свої переваги. 

Гамма- та рентгенівське випромінювання мають високу проникаючу здатність, що дозволяє використовувати їх для стерилізації предметів, що знаходяться всередині непроникних контейнерів. Головна перевага стерилізації електронним променем — практично миттєва стерилізація. Зазвичай її використовують як засіб поверхневої стерилізації через низьку проникаючу здатність електронних частинок, однак за умови достатньої енергії вона також може глибоко проникати в матерію.

Експлуатаційні витрати на рентгенівське, електронно-променеве та УФ-опромінення можуть бути відносно низькими, оскільки всі ці методи характеризуються ефективним використанням електроенергії. Початкові капітальні витрати на обладнання для рентгенівського, електронно-променевого та гамма-опромінення є високими [10]. Гамма-стерилізація пов’язана з постійними витратами на заміну джерела випромінювання, яким зазвичай є ізотоп кобальту-60. Однак слід враховувати, що, хоча операторів завжди слід захищати від шкідливого впливу всіх видів радіаційної стерилізації, фізична наявність радіоактивного матеріалу в гамма-стерилізаторах означає необхідність дотримання додаткових запобіжних заходів під час технічного обслуговування пристрою.    

Хімічні

Хімічні стерилізатори охоплюють широкий спектр рідин і газів, об’єднаних однією спільною рисою — здатністю знищувати мікроорганізми. Завдяки цим властивостям вони часто є шкідливими для людини, а іноді й смертельними. Найпоширеніший хімічний стерилізатор — етиленоксид — може спричиняти головний біль, нудоту, блювоту, діарею, задишку, подразнення дихальних шляхів, ураження легень та ціаноз у короткостроковій перспективі, тоді як тривалий вплив пов’язаний з випадками раку, мутагенними змінами, нейротоксичністю та сенсибілізацією [11]. 

Етиленоксид стерилізує шляхом алкілування білків, ДНК та РНК, що призводить до втрати життєздатності мікроорганізмів [7]. Цей процес відбувається через високу реакційну здатність сполуки, що також зумовлює логістичні ускладнення. Через поєднання токсичності та горючості етиленоксиду рекомендується зберігати його в окремому сховищі — із встановленою ізоляційною зоною радіусом 100 м на випадок витоку [12]. 

Як і більшість хімічних стерилізаторів, етиленоксид неефективний проти пріонів і може залишати залишки на стерилізованих поверхнях. Тривалість стерилізації також є значною — від 2 до 5 годин — а час обробки ще довший; часто він перевищує 14 годин через необхідність видалення парів після стерилізації. Проте він має високу проникаючу здатність, діє при низьких температурах (від 29 до 65 °C) і не вступає в реакцію з більшістю пластиків.  

Ще одним перспективним напрямком є стерилізація газовою плазмою. Газова плазма перекису водню утворюється шляхом збудження парів перекису водню в електричному полі, що призводить до утворення вільних радикалів, які денатурують біологічні матеріали, як і при процедурі іонізуючого випромінювання. Доведено, що газоплазмова стерилізація перекисом водню ефективна проти пріонів, працює при низьких температурах (37–44 °C) і має тривалість циклу менше 75 хвилин [13]. Однак цей процес має низьку проникаючу здатність, а перекис водню, на якому він базується, є токсичною та вибухонебезпечною речовиною.

Термічна стерилізація

Термічна стерилізація — найдавніший і найпростіший метод, який реалізується в двох формах: сухій та паровій. До її переваг належать здатність знищувати весь біологічний матеріал (у тому числі пріони) без утворення забруднювальних речовин чи залишків [14]. Ще однією перевагою є низька вартість, особливо щодо витратних матеріалів: як максимум, потрібні лише електроенергія та вода. Небезпека, пов’язана з термічною стерилізацією, також є низькою, хоча існує ризик опіків при дотику до гарячих стерилізованих предметів. 

Теплова стерилізація спочатку впливає на зовнішні поверхні об’єкта, що стерилізується, а потім поширюється всередину, доки не буде стерилізовано весь матеріал. Тепло денатурує білки, що містяться в мікроорганізмах та біологічному матеріалі, і оскільки пріони є білками, на них також впливає стерилізація теплом. Процес денатурації змінює водневі та дисульфідні зв’язки, а також сольові містки, і змінює вторинну, третинну та четвертинну структуру білків, роблячи їх непридатними для біологічних процесів [15].

Стерилізація сухим теплом передбачає створення середовища з температурою від 160 °C до 170 °C та підтримання її протягом 2–4 годин. Таке поєднання часу та температури унеможливлює стерилізацію теплочутливих матеріалів, таких як пластик, без деградації матеріалу [16]. Леза традиційно стерилізують сухим теплом, оскільки існують побоювання, що пара може призвести до їхнього затуплення. Однак дослідження показали, що леза з нержавіючої сталі, стерилізовані паром, демонструють незначне затуплення [17].

Стерилізація парою є швидшим і менш теплоємним процесом, ніж стерилізація сухим теплом. Пара передає теплову енергію ефективніше, ніж гаряче повітря, що дозволяє використовувати нижчу температуру (121–134 °C) та коротший час експозиції (3–15 хв) для стерилізації. Температура кипіння води при атмосферному тиску становить 100 °C, що є занадто низькою температурою для процесу стерилізації. Тому пар необхідно генерувати в умовах підвищеного тиску, що підвищує температуру кипіння води до необхідного рівня. 

Предмети, які витримують температуру 134 °C або нижче, можна стерилізувати парою, але вони повинні витримувати поєднання температури, вологи та тиску. Для таких об’єктів стерилізація парою є дуже ефективним та глибоко проникаючим методом стерилізації.

Висновок

Остаточний висновок щодо стерилізації не є однозначним. Однак можна зорієнтуватися у цій складній темі та знайти правильний варіант, зосередившись на конкретних предметах та необхідному стані після стерилізації.

Фільтрація є ефективним рішенням для стерилізації обмеженої кількості рідин, особливо чутливих до нагрівання, опромінення та хімічної стерилізації. Однак слід враховувати, що для інактивації мікроорганізмів цей метод потребує комбінації з іншими видами стерилізації.

Радіація, що охоплює безліч варіантів з різною здатністю до проникнення, є хорошим варіантом, якщо матеріали чутливі до тепла та можуть витримати її шкідливий вплив. Однак її впровадження є дорогим, і економічна ефективність залежить від масштабів її використання.

Хімічна стерилізація, незважаючи на токсичність, залишки реагентів, логістичні виклики та постійні витрати на витратні матеріали, залишається єдиним варіантом для об’єктів, несумісних з іншими методами — наприклад, твердих матеріалів, чутливих до тепла та радіації.

Для об’єктів, що нечутливі до тепла, вологи та певної міри тиску, стерилізація парою часто є найкращим вибором, забезпечуючи економічність, ефективність та швидкість. Це також стосується відходів, стан яких після стерилізації не має значення. Таким чином, автоклав залишається незамінним обладнанням для більшості лабораторій, тоді як системи деконтамінації стоків із паровим нагріванням (EDS) є ефективним рішенням для утилізації біологічно активних рідких відходів. Зверніться до компанії Astell Scientific за адресою Info@Astell.com, якщо вам потрібна додаткова інформація про стерилізацію теплом за допомогою пари.  

Аналіз характеру завантаженого матеріалу дозволяє обрати метод стерилізації, який найкраще відповідає вимогам. Для конкретного випадку можна оцінити поєднання швидкості, ефективності, сумісності з матеріалом, нетоксичності, адаптивності та можливості контролю, а також здатність подолати будь-який опір, який може проявлятися у матеріалі, що підлягає обробці. Звичайно, економічна ефективність буде ключовим фактором для більшості організацій.

Література

1. Шнайдер, П. (1994). Альтернативи низькотемпературній стерилізації в 1990-х роках. Tappi Journal; (США), 77(1).

2. Рутала, Вільям А. та Девід Дж. Вебер. «Клінічна ефективність технологій низькотемпературної стерилізації». Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798–804.

3. Кавіччіолі, Рікардо; Островський, Мартін (червень 2003 р.). «Енциклопедія наук про життя». Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Переглянуто 26 вересня 2017 р.

4. Дуда, В.; Сузіна, Н.; Полівцева, В.; Боронін, А. (2012). «Ультрамікробактерії: формування концепції та внесок ультрамікробактерій у біологію». Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Янссен, Петер; Шуманн, Александра; Мьоршель, Ерхард; Рейні, Фредерік (квітень 1997). «Нові анаеробні ультрамікробактерії, що належать до лінійного ряду Verrucomicrobiales, виділені методом розведення культури з бескисневого ґрунту рисових полів». Прикладна та екологічна мікробіологія. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Ризики використання стерилізації гамма-випромінюванням: інша сторона медалі. Int J Med Sci. 2018;15(3):274–279. Опубліковано 18 січня 2018 р. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Цю, Ц.-Ц., Сун, Венделл та Коннор, Дж. (2011). Стерилізація біоматеріалів синтетичного та біологічного походження. Comprehensive Biomaterials. 4. 127–144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Рутала, В. А., Вебер, Д. Дж. та Американське товариство епідеміології в охороні здоров’я. (2010). Керівництво з дезінфекції та стерилізації медичних інструментів, забруднених пріонами. «Infect Control Hosp Epidemiol», 31(2), 107–17.

9. Гоміне, М., Вадро, С., Острі, Г. та Дарборд, Ж. С. (2007). Інактивація інфекційності пріонів за допомогою іонізуючих променів. «Радіаційна фізика та хімія», 76(11–12), 1760–1762.

10. Сіммонс, А. (2012). Майбутні тенденції у стерилізації біоматеріалів та медичних виробів. У збірнику «Стерилізація біоматеріалів та медичних виробів» (с. 310–320). Woodhead Publishing.

11. Міністерство праці США, 2020. Етиленоксид. [онлайн] Адміністрація з питань безпеки та гігієни праці. Доступно за адресою: [Переглянуто 25 вересня 2020 р.].

12. Національний центр біотехнологічної інформації (2020). Короткий опис сполуки PubChem для CID 6354, етиленоксид. Отримано 23 вересня 2020 року з https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Газова плазма перекису водню | Керівництва з дезінфекції та стерилізації | Бібліотека керівництв | Контроль інфекцій. Отримано 27 вересня 2020 року з https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Стерилізація біоматеріалів та медичних виробів парою та сухим теплом. У книзі «Стерилізація біоматеріалів та медичних виробів» (с. 20–55). Woodhead Publishing.

15. Мауер, Л. (2003). ПРОТЕЇН| Термічна обробка харчових білків.

16. Вінні Р. Састрі (2014). Вимоги до матеріалів для пластмас, що використовуються у медичних виробах, у книзі «Пластмаси в медичних виробах» (друге видання).

17. Вендрелл, Р. Дж., Хейден, К. Л., та Талуміс, Л. Дж. (2002). Вплив стерилізації парою порівняно з сухим теплом на зношування ортодонтичних плоскогубців для обрізання лігатур. «Американський журнал ортодонтії та дентально-фаціальної ортопедії», 121(5), 467–471.

Вперше опубліковано в журналі «Labmate UK & Ireland», том 45, випуск 7.