Asepsis bereiken – Een sterilisatieprocedure kiezen.

De sterilisatie van micro-organismen en biologisch materiaal is een voorwaarde voor zowel experimentele als milieubeheersing in laboratoria binnen talrijke disciplines. 

Of het nu gaat om het waarborgen van aseptische omstandigheden in een kweekplaat of het handhaven van een biocontainmentzone, het doel van sterilisatie is altijd de uitroeiing van ongewenste biologische agentia. Dit doel kan worden bereikt via diverse procedurele methoden, die elk hun eigen voordelen en nadelen hebben.

Het ideale sterilisatieproces moet snel en effectief werken en micro-organismen en ongewenst biologisch materiaal, zoals prionen, onschadelijk maken. Het moet tevens zorgen voor minimale toxiciteit, minimale gezondheidsrisico’s voor operators en minimale veranderingen aan de gesteriliseerde voorwerpen, terwijl het maximale aanpasbaarheid biedt — geschikt voor verschillende materialen. De procedure moet bovendien in staat zijn om eventuele fysieke weerstand tegen sterilisatie, die door de te steriliseren materialen wordt vertoond, te overwinnen. Dit alles dient idealiter op een kostenefficiënte manier te worden bereikt, waarbij tevens consistente monitoring mogelijk is [1] [2]. 

Het is echter vaak onpraktisch om aan al deze voorwaarden te voldoen. Bijgevolg is het meenemen van veel van deze factoren vaak een secundaire overweging, afhankelijk van de situatie en de noodzaak, waarbij het primaire doel het bereiken van asepsis in een functioneel eindproduct is. Hieronder volgt een beoordeling van algemeen beschikbare sterilisatiemethoden, met hun voor- en nadelen.

Steriele filtratie

Indien een vloeibaar materiaal moet worden gesteriliseerd, is filtratie een optie die in overweging kan worden genomen. Een vloeistof of gas kan door een steriliserend filtermembraan worden geleid, dat een mechanische barrière vormt voor alle deeltjes met een grotere diameter dan de poriën in het membraan. Micro-organismen die groter zijn dan de poriën worden achter het filter tegengehouden, waardoor wordt gewaarborgd dat zij niet in het filtraat kunnen terechtkomen. 

Warmte, straling en chemische sterilisatiemiddelen werken door de fysieke structuren van moleculen en organellen binnen micro-organismen te veranderen – een proces dat ook de structurele componenten van gevoeliger stoffen kan wijzigen. Filtratie heeft dergelijke effecten niet, maar verwijdert uitsluitend deeltjes boven een bepaalde grootte. Als zodanig vormt filtratie een aannemelijke keuze voor meer instabiele en reactieve vloeistoffen.

In tegenstelling tot andere sterilisatiemethoden deactiveert filtratie microbiologische entiteiten niet. Daarom zijn aanvullende sterilisatieprocedures – vaak met behulp van warmte of straling – vereist om het filter en het residu na de bewerking te steriliseren.

Er moet ook nauwlettend worden gelet op de poriëngrootte van het filter. Vaak wordt een poriëngrootte van 0,2 μm gebruikt — en aangezien de kleinste mycoplasma’s ongeveer 0,3 μm meten — is dit voldoende om de meeste bacteriën uit te filteren. Ultramicobacteriën kunnen echter kleiner zijn dan 0,1 μm [3] [4] [5], terwijl virussen en prionen vaak nog kleiner zijn. Door de poriëngrootte te verkleinen tot 0,001 μm wordt ervoor gezorgd dat er minder microbiologische deeltjes in het filtraat terechtkomen, hoewel dit de filterbaarheid van vloeistoffen steeds verder beperkt. Een afname van de poriëngrootte leidt ook tot een langere verwerkingstijd – een filter met een poriëngrootte van 0,1 μm heeft ongeveer 40% van het debiet van een filter met een poriëngrootte van 0,2 μm.

Straling

Als sterilisatiemiddel komt straling in verschillende vormen voor. Neem bijvoorbeeld ioniserende straling, waaronder röntgenstraling, gammastraling en elektronenbundels. Deze technologieën steriliseren door deeltjes in het te steriliseren gebied elektromagnetisch te exciteren, waardoor deze vrije radicalen vrijgeven. Deze radicalen gaan een verbinding aan met de dubbele bindingen in biomoleculen (zoals DNA, RNA en enzymen), waardoor hun structuur verandert, hun functie wordt stilgelegd en de micro-organismen waarin ze voorkomen onbruikbaar worden. Niet-ioniserende stralingssterilisatiemiddelen werken door de vorming van nieuwe bindingen – pyrimidinedimeren – tussen de nucleobasen in het DNA te veroorzaken, wat – net als bij ioniserende straling – de structuur van het macromolecuul verandert en ervoor zorgt dat het niet meer functioneert. 

Vanwege hun werkingsmechanisme kunnen stralingssterilisatiemiddelen organische stoffen zoals kunststoffen [6] [7] en biologisch materiaal afbreken. Helaas strekken hun afbrekende effecten zich niet uit tot prionen, die over het algemeen te stabiel blijven om door stralingssterilisatiemiddelen te worden aangetast. [8] Het is echter vermeldenswaard dat sommige studies wijzen op de mogelijkheid van priondenaturatie door middel van gammastraling [9]. 

Een ander belangrijk aandachtspunt is dat het doordringend vermogen en de verwerkingstijden van stralingssterilisatiemiddelen aanzienlijk variëren.  Ultraviolet licht (UV) dringt alleen door transparante materialen, waardoor het geschikt is voor de sterilisatie van lucht en gezuiverd omgekeerd-osmosewater, maar bij ondoorzichtige stoffen is het beperkt tot oppervlakte-sterilisatie. De verwerkingstijd van UV kan eveneens uren in beslag nemen, net als bij röntgenstraling en gammastraling. Deze laatste twee methoden hebben echter hun eigen voordelen. 

Gamma- en röntgenstraling hebben een hoog doordringend vermogen, wat betekent dat ze kunnen worden gebruikt om voorwerpen te steriliseren die zich in anderszins ondoordringbare containers bevinden. Het grote voordeel van sterilisatie met een elektronenstraal is dat deze vrijwel onmiddellijk plaatsvindt. Vaak wordt deze methode gebruikt als oppervlakte-sterilisatiemiddel vanwege het geringe doordringend vermogen van de elektronendeeltjes – maar bij voldoende energie kan ook deze methode diep in de materie doordringen.

De exploitatiekosten voor röntgenstraling, elektronenbundels en UV-straling kunnen relatief laag zijn, waarbij efficiënt elektriciteitsverbruik een kenmerk is van elk van deze methoden. De aanschafkosten voor apparatuur voor röntgenstraling, elektronenbundels en gammastraling zijn hoog [10]. Gammasterilisatie brengt doorlopende kosten met zich mee die verband houden met de vervanging van de stralingsbron, doorgaans de kobalt-60-isotoop. Er dient echter te worden erkend dat, hoewel operators altijd moeten worden beschermd tegen de schadelijke effecten van alle stralingssterilisatiemethoden, de fysieke aanwezigheid van radioactief materiaal in gammasterilisatoren betekent dat er extra voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het onderhoud van het apparaat.    

Chemisch

Chemische sterilisatiemiddelen omvatten een breed scala aan vloeistoffen en gassen met één gemeenschappelijk kenmerk: hun vermogen om micro-organismen te vernietigen. Vanwege deze eigenschappen zijn zij vaak schadelijk voor de mens, zo niet dodelijk. Het meest gebruikte chemische sterilisatiemiddel – ethyleenoxide – kan op korte termijn hoofdpijn, misselijkheid, braken, diarree, kortademigheid, irritatie van de luchtwegen, longschade en cyanose veroorzaken, terwijl langdurige blootstelling in verband wordt gebracht met het ontstaan van kanker, mutagene veranderingen, neurotoxiciteit en sensibilisatie [11]. 

Ethyleenoxide-gas steriliseert door middel van de alkylering van eiwitten, DNA en RNA, waardoor micro-organismen niet meer levensvatbaar zijn [7]. Dit proces vindt plaats als gevolg van de hoge reactiviteit van de verbinding; een eigenschap die tot logistieke complicaties leidt. Vanwege de combinatie van toxiciteit en ontvlambaarheid wordt aanbevolen om ethyleenoxide op te slaan in een vrijstaande opslagruimte — met een isolatiezone met een straal van 100 m die is ingesteld voor het geval van een lek [12]. 

Net als de meeste chemische sterilisatiemiddelen is ethyleenoxide niet effectief tegen prionen en kan het residuen achterlaten op gesteriliseerde oppervlakken. De sterilisatietijd is bovendien lang – tussen de 2 en 5 uur – en de verwerkingstijd is nog langer; vaak meer dan 14 uur vanwege de verwijdering van dampen na de sterilisatie. Toch heeft het een hoog doordringend vermogen, werkt het bij lage temperaturen (tussen 29 en 65 °C) en reageert het niet met de meeste kunststoffen.  

Een andere interessante ontwikkeling op dit gebied is sterilisatie met gasplasma. Waterstofperoxide-gasplasma wordt gevormd door waterstofperoxidedamp te exciteren met behulp van een elektrisch veld, waardoor vrije radicalen ontstaan die biologisch materiaal denatureren, net als bij de procedure met ioniserende straling. Van waterstofperoxide-gasplasma is aangetoond dat het effectief is tegen prionen, bij lage temperaturen (37–44 °C) werkt en een cyclustijd van minder dan 75 minuten heeft [13]. Het proces heeft echter een gering doordringend vermogen en het waterstofperoxide waarop het berust, is een giftige, explosieve stof.

Warmtesterilisatie

Warmtesterilisatie is de oudste en eenvoudigste vorm van sterilisatie en kent twee varianten: droog en met stoom. Belangrijke voordelen van warmtesterilisatie zijn onder meer het vermogen om al het biologisch materiaal (inclusief prionen) te vernietigen, zonder dat er verontreinigingen of residuen achterblijven [14]. Een ander voordeel zijn de lage kosten, met name wat betreft verbruiksartikelen: er zijn hooguit elektriciteit en water nodig. De risico’s in verband met hittesterilisatie zijn eveneens gering, hoewel er een risico op brandwonden bestaat bij het aanraken van hete, gesteriliseerde voorwerpen. 

Warmtesterilisatie werkt eerst in op de buitenoppervlakken van het te steriliseren voorwerp en verspreidt zich vervolgens naar binnen totdat het gehele materiaal is gesteriliseerd. Warmte denatureert de eiwitten in micro-organismen en biologisch materiaal, en aangezien prionen eiwitten zijn, worden ook zij door warmtesterilisatie aangetast. Het denaturatieproces verandert waterstof- en disulfidebindingen, evenals zoutbruggen, en wijzigt de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur van eiwitten, waardoor deze ongeschikt worden voor biologische processen [15].

Bij droge hitte wordt een omgeving van 160 °C tot 170 °C gecreëerd, die twee tot vier uur wordt aangehouden. Door deze combinatie van tijd en temperatuur is het steriliseren van warmtegevoelig materiaal, zoals kunststoffen, met deze methode niet haalbaar zonder aantasting van het materiaal [16]. Messen worden traditioneel met droge hitte gesteriliseerd, aangezien men vreest dat stoom de scherpte ervan zou verminderen. Onderzoek toont echter aan dat roestvrijstalen messen na stoomsterilisatie slechts een verwaarloosbare mate van afstomping vertonen [17].

Sterilisatie met stoom is een sneller en minder warmte-intensief proces dan sterilisatie met droge hitte. Stoom draagt warmte-energie effectiever over dan hete lucht, wat betekent dat voor de sterilisatie een lagere temperatuur (121 °C – 134 °C) en een kortere tijd (3 tot 15 minuten) kunnen worden gebruikt. Het kookpunt van water bij atmosferische druk bedraagt 100 °C, wat een te lage temperatuur is voor het sterilisatieproces. Daarom moet stoom worden gegenereerd in een omgeving onder druk, waardoor het kookpunt van water tot de vereiste temperatuur wordt verhoogd. 

Voorwerpen die bestand zijn tegen een temperatuur van 134 °C of lager kunnen met stoom worden gesteriliseerd, maar moeten wel bestand zijn tegen een combinatie van temperatuur, vocht en druk. Voor voorwerpen die hiertegen bestand zijn, vormt stoomsterilisatie een zeer effectieve en diepgaande vorm van sterilisatie.

Samenvatting

De uiteindelijke keuze voor een sterilisatiemethode is niet eenduidig. Het is echter mogelijk om door de complexiteit heen te navigeren en de juiste optie te vinden door de nadruk te leggen op de betreffende voorwerpen en de vereiste toestand daarvan na sterilisatie.

Filtratie is een geschikte methode voor een beperkt aantal vloeistoffen – met name vloeistoffen die gevoelig zijn voor hitte, straling en chemische sterilisatie. Bij het nemen van beslissingen dient men zich echter bewust te zijn dat deze methode afhankelijk is van andere sterilisatievormen om micro-organismen via het filtratiemechanisme te deactiveren.

Straling, dat verschillende varianten met uiteenlopende penetratievermogen omvat, is een goede optie indien materialen warmtegevoelig zijn en de schadelijke effecten ervan kunnen weerstaan. De installatie ervan is echter kostbaar en de kosteneffectiviteit hangt af van de schaal waarop deze wordt toegepast.

Chemische sterilisatie, hoewel gepaard gaande met toxiciteit, residuen en logistieke problemen, naast doorlopende kosten voor verbruiksartikelen, speelt een rol wanneer het te steriliseren object ongeschikt is voor andere sterilisatietechnieken – bijvoorbeeld een hitte- en stralingsgevoelig vast materiaal.

Voor objecten die bestand zijn tegen hitte, vocht en – tot op zekere hoogte – druk, komt stoomsterilisatie vaak naar voren als de beste keuze; deze methode biedt kostenefficiëntie, effectiviteit en snelheid. Dit geldt eveneens voor afvalstoffen, waarbij de toestand na sterilisatie niet van belang is. Daarom blijft een autoclaaf onmisbare apparatuur voor vrijwel alle laboratoria, terwijl met stoom verwarmde systemen voor de ontsmetting van afvalwater (EDS) een uitstekende optie bieden voor laboratoria die biologisch actief vloeibaar afval moeten afvoeren. Neem contact op met Astell Scientific via Info@Astell.com indien u meer informatie wenst over stoomgebaseerde hittesterilisatie.  

Door analyse van het te steriliseren materiaal is het mogelijk om een sterilisatietechniek te vinden die het beste aansluit bij het ideale model. Een combinatie van snelheid, doeltreffendheid, materiaalcompatibiliteit, niet-toxiciteit, aanpasbaarheid en de mogelijkheid tot monitoring kan voor de betreffende situatie worden beoordeeld, naast het vermogen om eventuele materiaalweerstand in het doelmateriaal te overwinnen. Uiteraard zal kosteneffectiviteit voor de meeste organisaties een belangrijke factor zijn.

Referenties

1. Schneider, P. (1994). Alternatieven voor sterilisatie bij lage temperatuur in de jaren negentig. Tappi Journal; (Verenigde Staten), 77(1).

2. Rutala, William A., en David J. Weber. „Klinische effectiviteit van sterilisatietechnologieën bij lage temperatuur.” Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998): 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo; Ostrowski, Martin (juni 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Geraadpleegd op 26 september 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). „Ultramicrobacteriën: het ontstaan van het concept en de bijdrage van ultramicrobacteriën aan de biologie”. Microbiology. 81 (4): 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (april 1997). "Nieuwe anaërobe ultramicrobacteriën behorend tot de Verrucomicrobiales-stam van bacteriële afstamming, geïsoleerd door middel van verdunningscultuur uit zuurstofloze rijstvelden". Applied and Environmental Microbiology. 63 (4): 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Risico’s van sterilisatie door gammastraling: de keerzijde van de medaille. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Gepubliceerd op 18 januari 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell & Connor, J. (2011). Sterilisatie van biomaterialen van synthetische en biologische oorsprong. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., & Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Richtlijn voor de desinfectie en sterilisatie van met prionen besmette medische instrumenten. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., & Darbord, J. C. (2007). Inactivering van prioninfectiviteit door ioniserende straling. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Toekomstige trends voor de sterilisatie van biomaterialen en medische hulpmiddelen. In Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (blz. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Ministerie van Arbeid van de Verenigde Staten, 2020. Ethyleenoxide. [online] Occupational Safety and Health Administration. Beschikbaar op: [Geraadpleegd op 25 september 2020].

12. National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem-samenvatting van de verbinding voor CID 6354, ethyleenoxide. Op 23 september 2020 opgehaald van https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020) Waterstofperoxide-gasplasma | Richtlijnen voor desinfectie en sterilisatie | Richtlijnenbibliotheek | Infectiebeheersing. Op 27 september 2020 geraadpleegd via https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Sterilisatie van biomaterialen en medische hulpmiddelen met stoom en droge hitte. In Sterilisatie van biomaterialen en medische hulpmiddelen (pp. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN| Warmtebehandeling van voedselproteïnen.

16. Vinny R. Sastri (2014). Materiaaleisen voor kunststoffen die worden gebruikt in medische hulpmiddelen, in „Plastics in Medical Devices” (tweede editie).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L., & Taloumis, L. J. (2002). Effect van sterilisatie met stoom versus droge hitte op de slijtage van orthodontische ligatuursnijtangen. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, 121(5), 467-471.

Voor het eerst gepubliceerd in Labmate UK & Ireland, jaargang 45, nummer 7.