Assurer l’asepsie – Choisir une méthode de stérilisation.

La stérilisation des micro-organismes et des matières biologiques est une condition préalable au contrôle tant expérimental qu’environnemental dans les laboratoires de nombreuses disciplines. 

Qu’il s’agisse d’assurer des conditions aseptiques dans une plaque de culture ou de maintenir une zone de confinement biologique, l’objectif de la stérilisation est toujours l’éradication des agents biologiques indésirables. Cet objectif peut être atteint par diverses méthodes, chacune présentant ses propres avantages et inconvénients.

Le processus de stérilisation idéal doit agir rapidement et efficacement, en inactivant les micro-organismes et les matières biologiques indésirables telles que les prions. Il doit également garantir une toxicité minimale, des risques sanitaires réduits pour les opérateurs et une altération minimale des objets stérilisés, tout en offrant une adaptabilité maximale — s’adaptant à différents matériaux. La procédure doit également être capable de surmonter toute résistance physique à la stérilisation présentée par les matériaux à stériliser. Idéalement, tout cela doit être réalisé de manière rentable tout en permettant une surveillance constante [1] [2]. 

Il est toutefois souvent difficile de remplir toutes ces conditions. Par conséquent, la prise en compte d’un grand nombre de ces facteurs est souvent reléguée au second plan, en fonction de la situation et des besoins, l’objectif principal étant d’obtenir un produit final fonctionnel et aseptisé. Vous trouverez ci-après une évaluation des méthodes de stérilisation couramment disponibles, ainsi que de leurs avantages et inconvénients.

Filtration stérile

Lorsqu’il s’agit de stériliser un produit fluide, la filtration constitue une option à envisager. Un liquide ou un gaz peut être fait passer à travers une membrane filtrante stérilisante, qui forme une barrière mécanique contre toutes les particules dont le diamètre est supérieur à celui des pores de la membrane. Les micro-organismes plus gros que les pores sont piégés derrière le filtre, ce qui garantit qu’ils ne peuvent pas pénétrer dans le filtrat. 

La chaleur, les rayonnements et les agents stérilisants chimiques modifient les structures physiques des molécules et des organites au sein des micro-organismes, un processus susceptible d’altérer les composants structurels de substances plus sensibles. La filtration n’exerce pas de tels effets ; elle se contente d’éliminer les particules dépassant une certaine taille. À ce titre, la filtration constitue une option pertinente pour les fluides plus instables et réactifs.

Contrairement à d’autres méthodes de stérilisation, la filtration n’inactive pas les entités microbiologiques. Par conséquent, d’autres procédures de stérilisation — souvent la chaleur ou le rayonnement — sont nécessaires pour stériliser le filtre et les résidus après le traitement.

Il convient également d’accorder une attention particulière à la taille des pores du filtre. On utilise fréquemment une taille de pores de 0,2 μm — et, le plus petit mycoplasme mesurant environ 0,3 μm, cela suffit pour filtrer la plupart des bactéries. Cependant, les ultramicrobactéries peuvent mesurer moins de 0,1 μm [3] [4] [5], tandis que les virus et les prions sont souvent encore plus petits. La réduction de la taille des pores à 0,001 μm garantit qu’un nombre moindre d’entités microbiologiques puisse pénétrer dans le filtrat, bien que cela devienne de plus en plus contraignant pour les fluides pouvant être filtrés. Une diminution de la taille des pores augmente également la durée de traitement : un filtre à pores de 0,1 μm aura un débit d’environ 40 % de celui d’un filtre à pores de 0,2 μm.

Rayonnement

En tant qu’agent stérilisant, le rayonnement revêt de multiples formes. Prenons, par exemple, les agents stérilisants à rayonnement ionisant, notamment les rayons X, les rayons gamma et les faisceaux d’électrons. Ces technologies stérilisent en excitant électromagnétiquement les particules présentes dans la zone à stériliser, ce qui les amène à libérer des radicaux libres. Ces radicaux se lient aux doubles liaisons des biomolécules (telles que l’ADN, l’ARN et les enzymes), modifiant leur structure, interrompant leur fonction et rendant inactifs les micro-organismes qui les contiennent. Les agents stérilisants par rayonnement non ionisant agissent en provoquant la formation de nouvelles liaisons – des dimères de pyrimidine – entre les bases nucléiques de l’ADN, ce qui, tout comme avec le rayonnement ionisant, modifie la structure de la macromolécule et en bloque le fonctionnement. 

En raison de leur mode d’action, les agents stérilisants par rayonnement peuvent dégrader des composés organiques tels que les plastiques [6] [7] et les matières biologiques. Malheureusement, leurs effets dégradants ne s’étendent pas aux prions, qui restent globalement trop stables pour être affectés par ces agents stérilisants [8]. Il convient toutefois de noter que certaines études indiquent une possibilité de dénaturation des prions par rayonnement gamma [9]. 

Il convient également de tenir compte du fait que la capacité de pénétration et les temps de traitement des agents stérilisants par rayonnement varient considérablement.  La lumière ultraviolette (UV) ne peut pénétrer que les matériaux transparents, ce qui en fait un agent stérilisant viable pour l’air et l’eau purifiée par osmose inverse, mais elle se limite à une stérilisation de surface pour les substances opaques. La durée de traitement des UV peut également s’étendre sur plusieurs heures, comme c’est le cas pour les rayons X et les rayons gamma. Toutefois, ces deux dernières méthodes présentent leurs propres avantages. 

Les rayons gamma et les rayons X sont hautement pénétrants, ce qui permet de stériliser des objets placés à l’intérieur de contenants par ailleurs imperméables. Le principal atout de la stérilisation par faisceau d’électrons réside dans sa capacité à stériliser de manière quasi instantanée. Elle est souvent utilisée comme stérilisant de surface en raison de la faible capacité de pénétration des particules d’électrons ; toutefois, si l’énergie fournie est suffisante, elle peut elle aussi pénétrer profondément dans la matière.

Les coûts d’exploitation des rayons X, du faisceau d’électrons et des UV peuvent être relativement faibles, chacune de ces méthodes se caractérisant par une utilisation efficace de l’électricité. Les équipements à rayons X, à faisceau d’électrons et à rayons gamma présentent toutefois un coût d’investissement initial élevé [10]. La stérilisation par rayons gamma entraîne des coûts récurrents liés au remplacement de sa source de rayonnement, généralement l’isotope cobalt-60. Il convient toutefois de reconnaître que, bien que les opérateurs doivent toujours être protégés contre les effets néfastes de tous les agents stérilisants par rayonnement, la présence physique de matières radioactives dans les stérilisateurs gamma implique que des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l’entretien de l’appareil.    

Chimiques

Les agents stérilisants chimiques englobent une vaste gamme de liquides et de gaz qui partagent une caractéristique commune : leur capacité à détruire la vie microbienne. En raison de ces caractéristiques, ils sont souvent nocifs pour l’être humain, voire mortels. L’agent stérilisant chimique le plus couramment utilisé — l’oxyde d’éthylène — peut provoquer à court terme des maux de tête, des nausées, des vomissements, de la diarrhée, un essoufflement, une irritation respiratoire, des lésions pulmonaires et une cyanose, tandis qu’une exposition à long terme est associée à l’apparition de cancers, à des modifications mutagènes, à une neurotoxicité et à une sensibilisation [11]. 

L’oxyde d’éthylène stérilise par alkylation des protéines, de l’ADN et de l’ARN, ce qui rend les micro-organismes non viables [7]. Ce processus résulte de la forte réactivité du composé, caractéristique source de contraintes logistiques. En raison de sa toxicité et de son inflammabilité, il est recommandé de stocker l’oxyde d’éthylène dans une unité de stockage indépendante — avec une zone d’isolement d’un rayon de 100 m établie en cas de fuite [12]. 

Comme la plupart des agents stérilisants chimiques, l’oxyde d’éthylène est inefficace contre les prions et peut laisser des résidus sur les surfaces stérilisées. Sa durée de stérilisation est également longue — entre 2 et 5 heures — et son temps de traitement l’est encore davantage ; il dépasse souvent 14 heures en raison de l’élimination des vapeurs après la stérilisation. Il présente toutefois un fort pouvoir de pénétration, agit à basse température (entre 29 et 65 °C) et ne réagit pas avec la plupart des plastiques.  

Une autre avancée intéressante dans ce domaine est la stérilisation par plasma gazeux. Le plasma gazeux de peroxyde d’hydrogène est créé en excitant la vapeur de peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un champ électrique, ce qui provoque la formation de radicaux libres qui dénaturent les matières biologiques, comme dans le cas du procédé par rayonnement ionisant. Le plasma gazeux de peroxyde d’hydrogène s’est révélé efficace contre les prions, fonctionne à basse température (de 37 à 44 °C) et présente une durée de cycle inférieure à 75 minutes [13]. Toutefois, ce procédé présente une faible capacité de pénétration et le peroxyde d’hydrogène sur lequel il repose est une substance toxique et explosive.

Chaleur

La stérilisation thermique est la méthode de stérilisation la plus ancienne et la plus simple ; elle se présente sous deux formes : à sec et à la vapeur. Parmi les principaux avantages de la stérilisation thermique, on peut citer sa capacité à détruire toute matière biologique (y compris les prions), sans laisser de contaminants ni de résidus [14]. Autre atout : un coût d’exploitation réduit, car seuls l’électricité et l’eau sont nécessaires. Les risques liés à la stérilisation thermique sont faibles, bien qu’un risque de brûlure subsiste en cas de contact avec des objets encore chauds. 

La chaleur agit d’abord sur les surfaces externes de l’objet à stériliser, puis se propage vers l’intérieur jusqu’à ce que l’ensemble du matériau soit traité. La chaleur dénature les protéines présentes dans les micro-organismes et les matières biologiques ; les prions étant des protéines, ils sont également affectés par la stérilisation thermique. Le processus de dénaturation modifie les liaisons hydrogène, les liaisons disulfure et les ponts salins, et altère les structures secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines, les rendant inaptes aux processus biologiques [15].

La stérilisation par chaleur sèche consiste à créer un environnement à une température comprise entre 160 °C et 170 °C et à le maintenir pendant deux à quatre heures. Cette combinaison de durée et de température rend impossible la stérilisation, par cette méthode, de matériaux sensibles à la chaleur tels que les plastiques sans entraîner leur dégradation [16]. Les lames ont traditionnellement été stérilisées à la chaleur sèche, car on craint que la vapeur ne les émousse. Toutefois, des études ont démontré qu’un émoussement négligeable se produit sur les lames en acier inoxydable stérilisées à la vapeur [17].

La stérilisation à la vapeur est un procédé plus rapide et moins exigeant en chaleur que la stérilisation à la chaleur sèche. La vapeur transfère l’énergie thermique plus efficacement que l’air chaud, ce qui signifie qu’une température plus basse (de 121 °C à 134 °C) et une durée plus courte (de 3 à 15 minutes) suffisent pour la stérilisation. Le point d’ébullition de l’eau à la pression atmosphérique étant de 100 °C, la vapeur est générée sous pression afin d’élever le point d’ébullition à la température de stérilisation requise. 

Les articles supportant une température de 134 °C ou moins peuvent être stérilisés à la vapeur, à condition de résister à l’association de chaleur, d’humidité et de pression. Pour les charges compatibles, la stérilisation à la vapeur offre une pénétration et une efficacité élevées.

Résumé

Le choix de la méthode de stérilisation dépend avant tout de la nature des charges et des exigences post-stérilisation.

La filtration constitue une solution adaptée pour un nombre limité de liquides, notamment ceux sensibles à la chaleur, aux rayonnements et aux agents chimiques. Toutefois, ce procédé doit être associé à d’autres techniques afin d’inactiver totalement les micro-organismes.

Couvrant de multiples variantes aux capacités de pénétration variées, le rayonnement constitue une bonne option lorsque les matériaux sont sensibles à la chaleur et peuvent résister à ses effets néfastes. Toutefois, sa mise en place est coûteuse et sa rentabilité dépend de l’ampleur de son utilisation.

La stérilisation chimique, bien qu’elle soulève des préoccupations liées à la toxicité, aux résidus et à la logistique, ainsi qu’à des coûts de consommables récurrents, a son rôle à jouer lorsque l’objet à stériliser est incompatible avec d’autres techniques de stérilisation – par exemple, un matériau solide sensible à la chaleur et aux rayonnements.

Pour les charges non sensibles à la chaleur, à l’humidité et, dans une certaine mesure, à la pression, la stérilisation à la vapeur constitue souvent le choix le plus pertinent, offrant un bon rapport coût-efficacité, une grande fiabilité et une rapidité d’exécution. Il en va de même pour les matières résiduelles, dont l’état après stérilisation ne présente pas d’importance. Ainsi, l’autoclave demeure un équipement essentiel pour la quasi-totalité des laboratoires, tandis que les systèmes de décontamination des effluents par vapeur (EDS) constituent une excellente option pour ceux qui doivent éliminer des déchets liquides biologiquement actifs. Pour obtenir de plus amples renseignements sur la stérilisation thermique à la vapeur, veuillez contacter Astell Scientific à l’adresse Info@Astell.com.  

L’analyse du matériau à stériliser permet de déterminer la technique la mieux adaptée au modèle idéal. Une combinaison de rapidité, d’efficacité, de compatibilité avec le matériau, de non-toxicité, d’adaptabilité et de possibilité de surveillance peut être évaluée en fonction de la situation requise, parallèlement à la capacité de surmonter toute résistance que pourrait présenter le matériau cible. Bien entendu, la rentabilité constituera un facteur clé pour la plupart des organisations.

Références

1. Schneider, P. (1994). Les alternatives de stérilisation à basse température dans les années 1990. Tappi Journal; (États-Unis), 77(1).

2. Rutala, William A., et David J. Weber. « Efficacité clinique des technologies de stérilisation à basse température ». Infection Control & Hospital Epidemiology 19.10 (1998) : 798-804.

3. Cavicchioli, Ricardo ; Ostrowski, Martin (juin 2003). Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. ISBN 9780470015902. Consulté le 26 septembre 2017.

4. Duda, V; Suzina, N; Polivtseva, V; Boronin, A (2012). « Ultramicrobactéries : émergence du concept et contribution des ultramicrobactéries à la biologie ». Microbiology. 81 (4) : 379–390. doi:10.1134/s0026261712040054. 

5. Janssen, Peter; Schuhmann, Alexandra; Mörschel, Erhard; Rainey, Frederick (avril 1997). « Nouvelles ultramicrobactéries anaérobies appartenant à la lignée des Verrucomicrobiales, isolées par culture par dilution à partir d’un sol de rizière anoxique ». Microbiologie appliquée et environnementale. 63 (4) : 1382–1388. PMC 168432.

6. Harrell CR, Djonov V, Fellabaum C, Volarevic V. Risques liés à l’utilisation de la stérilisation par rayonnement gamma : le revers de la médaille. Int J Med Sci. 2018;15(3):274-279. Publié le 18 janvier 2018. doi:10.7150/ijms.22644. 

7. Qiu, Q.-Q., Sun, Wendell et Connor, J. (2011). Stérilisation des biomatériaux d’origine synthétique et biologique. Comprehensive Biomaterials. 4. 127-144. 10.1016/B978-0-08-055294-1.00248-8.

8. Rutala, W. A., Weber, D. J., et la Society for Healthcare Epidemiology of America. (2010). Lignes directrices pour la désinfection et la stérilisation des instruments médicaux contaminés par des prions. Infect Control Hosp Epidemiol, 31(2), 107-17.

9. Gominet, M., Vadrot, C., Austruy, G., et Darbord, J. C. (2007). Inactivation de l’infectiosité des prions par les rayons ionisants. Radiation Physics and Chemistry, 76(11-12), 1760-1762.

10. Simmons, A. (2012). Tendances futures en matière de stérilisation des biomatériaux et des dispositifs médicaux. Dans Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices (p. 310-320). Woodhead Publishing.

11. Ministère du Travail des États-Unis, 2020. Oxyde d’éthylène. [en ligne] Administration de la sécurité et de la santé au travail. Disponible à l’adresse : [Consulté le 25 septembre 2020].

12. Centre national d’information sur les biotechnologies (2020). Résumé du composé PubChem pour le CID 6354, oxyde d’éthylène. Consulté le 23 septembre 2020 à l’adresse https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene-oxide. )

13. Cdc.gov (2020). Plasma de peroxyde d’hydrogène | Lignes directrices sur la désinfection et la stérilisation | Bibliothèque des lignes directrices | Contrôle des infections. Consulté le 27 septembre 2020 à l’adresse https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/hydrogen-peroxide-gas.html. 

14. Rogers, W. J. (2012). Stérilisation à la vapeur et à la chaleur sèche des biomatériaux et des dispositifs médicaux. Dans Stérilisation des biomatériaux et des dispositifs médicaux (p. 20-55). Woodhead Publishing.

15. Mauer, L. (2003). PROTEIN | Traitement thermique des protéines alimentaires.

16. Vinny R. Sastri (2014). Exigences relatives aux matériaux pour les plastiques utilisés dans les dispositifs médicaux, dans *Plastics in Medical Devices* (deuxième édition).

17. Vendrell, R. J., Hayden, C. L. et Taloumis, L. J. (2002). Effet de la stérilisation à la vapeur par rapport à la stérilisation à la chaleur sèche sur l’usure des pinces orthodontiques de coupe de ligatures. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, 121(5), 467-471.

Publié pour la première fois dans Labmate UK & Ireland, volume 45, numéro 7.