Pintu ruang dibuka, dan benda-benda yang akan disterilisasi dimasukkan ke dalam ruang. Dalam contoh ini, benda-benda yang akan disterilisasi dimasukkan ke dalam wadah limbah Morrison. Jika air di generator uap hampir habis, generator uap akan mengisi ulang airnya secara otomatis.

Pompa vakum menarik udara dari ruang sterilisasi, menciptakan tekanan yang lebih rendah di dalam ruang dan mengeluarkan sebagian udara yang terperangkap di dalam benda-benda yang akan disterilkan.

Sebuah katup terbuka, dan uap dari generator uap mengisi ruang, meningkatkan tekanan di dalam ruang serta mengeluarkan lebih banyak udara yang terperangkap di dalam benda-benda di dalam ruang.

Tekanan di dalam ruang mengalami siklus berulang berupa penambahan tekanan dengan uap, kemudian pengurangan tekanan dengan vakum. Hal ini memampatkan dan mengembang udara yang terperangkap di dalam ruang, mengeluarkannya dari kantong-kantong udara hingga seluruh udara telah digantikan oleh uap.

Generator uap terus beroperasi, menambahkan lebih banyak uap ke dalam ruang autoklaf. Seiring bertambahnya uap yang ditambahkan, tekanan dan suhu pun meningkat. Setelah ruang mencapai 121°C atau lebih tinggi, proses sterilisasi muatan dimulai. Suhu dipertahankan selama periode yang telah ditentukan untuk memastikan sterilisasi yang sempurna.

Setelah sterilisasi selesai, katup ke generator uap ditutup, dan ruang autoklaf mendingin. Seiring turunnya suhu dan tekanan, uap mengembun menjadi air, yang terkumpul di dasar ruang autoklaf. Ketika tekanan kembali normal, katup akan mengalirkan air tersebut dan pintu ruang autoklaf dapat dibuka dengan aman.