A porta da câmara é aberta e os itens a serem esterilizados são colocados dentro da câmara. Neste exemplo, os objetos a serem esterilizados estão contidos em recipientes descartáveis da marca Morrison. Quando o gerador de vapor estiver com pouco nível de água, ele se reabastecerá automaticamente.

A bomba de vácuo extrai o ar da câmara, criando uma pressão mais baixa em seu interior e removendo parte do ar preso nos itens que precisam ser esterilizados.

Uma válvula se abre, e o vapor proveniente do gerador de vapor preenche a câmara, aumentando a pressão em seu interior e removendo mais ar preso nos itens dentro da câmara.

A pressão na câmara passa por ciclos repetidos de pressurização com vapor, seguidos de despressurização por meio do vácuo. Isso comprime e expande o ar retido na câmara, expulsando-o das cavidades até que todo o ar tenha sido substituído por vapor.

O gerador de vapor continua operando, adicionando mais vapor à câmara da autoclave. À medida que mais vapor é adicionado, a pressão e a temperatura aumentam. Assim que a câmara atinge 121 °C ou mais, inicia-se a esterilização da carga. A temperatura é mantida por um período predefinido para garantir a esterilização completa.

Assim que a esterilização for concluída, a válvula do gerador de vapor é fechada e a câmara esfria. À medida que a temperatura e a pressão caem, o vapor se condensa em água, que se acumula no fundo da câmara. Quando a pressão se equaliza, uma válvula drena a água e a porta da câmara pode ser aberta com segurança.