A porta da câmara é aberta e os artigos a esterilizar são colocados no interior da câmara. Neste exemplo, os objetos a esterilizar encontram-se dentro de recipientes descartáveis da marca Morrison. Quando o gerador de vapor estiver com pouco nível de água, este reabastece-se automaticamente.

A bomba de vácuo extrai o ar da câmara, criando uma pressão mais baixa no seu interior e libertando parte do ar retido nos artigos que necessitam de esterilização.

Uma válvula abre-se e o vapor proveniente do gerador de vapor enche a câmara, aumentando a pressão no seu interior e expulsando mais ar retido nos artigos presentes na câmara.

A pressão na câmara passa por ciclos repetidos de pressurização com vapor, seguidos de despressurização com vácuo. Isto comprime e expande o ar retido na câmara, expulsando-o das cavidades até que todo o ar tenha sido substituído por vapor.

O gerador de vapor continua a funcionar, adicionando mais vapor à câmara da autoclave. À medida que é adicionado mais vapor, a pressão e a temperatura aumentam. Assim que a câmara atinge 121 °C ou mais, inicia-se a esterilização da carga. A temperatura é mantida durante um período predefinido para garantir a esterilização completa.

Assim que a esterilização estiver concluída, a válvula do gerador de vapor é fechada e a câmara arrefece. À medida que a temperatura e a pressão descem, o vapor condensa-se em água, que se acumula no fundo da câmara. Quando a pressão se equaliza, uma válvula drena a água e a porta da câmara pode ser aberta com segurança.