Drzwi komory zostają otwarte, a przedmioty przeznaczone do sterylizacji umieszcza się wewnątrz komory. W tym przykładzie przedmioty przeznaczone do sterylizacji znajdują się w pojemnikach na odpady firmy Morrison. Gdy w generatorze pary poziom wody spadnie, urządzenie automatycznie uzupełni zapas wody.

Pompa próżniowa usuwa powietrze z komory, tworząc w niej podciśnienie i wypierając część powietrza uwięzionego w przedmiotach przeznaczonych do sterylizacji.

Otwiera się zawór, a para z generatora pary wypełnia komorę, zwiększając ciśnienie wewnątrz komory i usuwając kolejną część powietrza uwięzionego w przedmiotach znajdują się w komorze.

Ciśnienie w komorze podlega powtarzającym się cyklom zwiększania ciśnienia za pomocą pary wodnej, a następnie obniżania ciśnienia za pomocą próżni. Powoduje to sprężanie i rozprężanie powietrza uwięzionego w komorze, co pozwala na jego usunięcie z zagłębień, aż całe powietrze zostanie zastąpione parą wodną.

Generator pary kontynuuje pracę, dostarczając kolejne porcje pary do komory autoklawu. W miarę dostarczania pary wzrasta ciśnienie i temperatura. Gdy temperatura w komorze osiągnie 121°C lub więcej, rozpoczyna się sterylizacja zawartości. Temperatura jest utrzymywana przez z góry określony czas w celu zapewnienia całkowitej sterylizacji.

Po zakończeniu sterylizacji zawór doprowadzający parę do generatora zostaje zamknięty, a komora ulega schłodzeniu. Wraz ze spadkiem temperatury i ciśnienia para skrapla się w wodę, która gromadzi się na dnie komory. Gdy ciśnienie się wyrówna, zawór spuszcza wodę i można bezpiecznie otworzyć drzwiczki komory.